流式微球阵列术（CBA)检测细胞因子室内质控方法的初步建立

谢闻悦，聂李平，黄铭杰，李博文

（1.北京大学深圳医院检验科，广东 深圳 518000；2.福建省福州市长乐区妇幼保健院检验科，福建 福州 350299）

流式微球阵列术(cytometric bead arry,CBA)是液相多重蛋白定量技术，是以流式细胞仪为检测平台，以不同大小或携带不同荧光信号的微球为载体，能同时定量测量样品中的多种可溶性分子和细胞因子，具有高通量、线性范围广、准确性高、重复性好等诸多优点[1]，该技术建立以后被广泛地用于临床诊断与基础医学研究中[2-4]。细胞因子在检测标本中含量低，样本数量少，传统的方法无法满足多因子检测；CBA法可一次性定量检测细胞因子多，用时短，标本用量少，尤其适用于微量样本。但该方法操作过程繁琐，影响因素多，检测过程中易受人为因素影响[5，6]，因而如何保证检测结果的稳定可靠尤为重要。由于目前市场中尚无商品化的稳定质控物，也未见关于细胞因子质控方法建立的文献报道，本实验室拟通过自制质控品，初步探讨建立CBA技术检测细胞因子的室内质控方法，为及时找出测定误差，以保证细胞因子检测的质量。

1 材料和方法

1.1 设备及试剂

1.1.1 仪器 贝克曼navios流式细胞仪。

1.1.2 试剂Aim Plex多因子流式检测IFN-r/IL-8试剂盒(北京旷博生物技术有限公司)。

1.1.3 分析软件FCAPS流式细胞分析软件。

1.2 实验方法

1.2.1 质控品的制备

1.2.1.1 阳性血浆 吸取2019年12月一名CAR-T治疗后出现2级细胞因子风暴（CRS）患者EDTA抗凝血浆1ml，其IL-10检测结果为130.26ng/L，IL-8检测结果为127.5ng/L。

1.2.1.2 阴性血浆 吸取2019年12月来本院体检的健康体检者EDTA抗凝血浆各1ml，IL-10检测结果分别为0.52ng/L、0.73ng/L，IL-8检测结果分别为1.32ng/L、2.17ng/L。

1.2.1.3 将阳性血浆与阴性血浆混合后,分装为60 ul/管，-80℃迅速冻存。

1.2.2 操作步骤 按照试剂操作说明书，标准品被稀释成7个梯度浓度，和自制质控样本各取45μl与IL-10/IL-8微球混悬液45μl室温混合避光震荡孵育1h，洗涤后加入二抗25μl混合震荡孵育30min,二次洗涤后加入链合亲霉素-PE25ul震荡孵育30min后,洗涤加入读数液200μl上机获取数据。

1.2.3 数据分析 打开FCAPS软件创建实验模板，建立标准曲线,设门圈出样本微球，计算样本浓度。

1.3 质控方法 本实验室质控方法先采用“即刻法”，当每个质控品种检测的数据点超过20个后，转入使用Levey-Jennings(L-J)质控图法。

1.3.1 “即刻法”的建立 按文献做法[7]，先测定两次质控值，从第三次开始，每次计算其平均值x和标准差s，再根据公式SI上限=(x最大值-x)/s,SI下限=(x-x最小值)/s算出SI值,将其值与SI界值表中数据作比较。当SI上限和S1下限都小于其界值表中n2s的值时，说明其结果可靠处于在控，可以继续进行试验，当其中有一个值大于界值表的n2s且小于n3s时，该状态处于警告，当其中有一个值大于n3s时，则说明该质控结果处于失控状态，对于失控和警告状态的值，选择舍去一个离散程度最大的值。

表1 SI值表

1.3.2 Levey—Jennings质控方法建立 在测定20次的质控值后，计算出其平均值，以及标准差s，按westgard的3s标准进行判断，即以x±3s作图建立一个质控框架图，将同批质控品和检测试剂测定的结果描人上述所做的质控图中，当描入的质控值大于x+3s或小于x-3s时，即说明该质控值已处于失控状态，对于这样的值，需要寻找失控的原因，并重新测定该值。

2 结果

2.1 IL-10质控结果 表2为IL-10即刻法结果，图1是按表2数据所做的L—J法质控图(x=43.23，SD=5.90)。IL-10即刻法未见警告或失控数据，而在L—J法中第13点(30.26)大于x-2s小于x-3s，判定结果为警告状态，其余结果在控。见表2，图1。

图1 IL-10 20个质控测定值应用L—J法绘制质控图(x=43.23，SD=5.90，CV=13.66%)

表2 IL-10 20个质控值应用即刻法绘制质控表

2.2 IL-8质控结果 表3为IL-8即刻法20次测定结果，图2是按表3数据所做的L—J法质控图(x=50.11，SD=9.28，CV=18.52%)。即刻法第4组数据出现告警，而L-J图显示在控状态；第20组数据则即刻法、L-J图同时出现警告。在剔除第4点告警值后，发现即刻法第13点数据告警状态浮现,见表4。剔除即刻法3次告警值并补充第21、22、23点测定值（分别是58.71、34.77、57.71）后，重新计算IL-8的均值、变异系数为x=47.86，SD=7.27，CV=15.19%。

表4 IL-8删除第4点告警值后部分数据即刻法质控表

图2 IL-8前20个质控测定值应用L—J法绘制质控图(x=50.11，SD=9.28，CV=18.52%)

表3 IL-8前20个质控值应用即刻法绘制质控表

3 讨论

细胞因子在许多疾病的发生发展过程中起重要作用，检测其含量有助于判断疾病活动程度，因此细胞因子测定结果准确性对于临床的治疗有着非常重要的影响。随着细胞因子检测在临床的广泛应用，建立好室内质量质控（ICQ)保证样本测定结果的准确性和稳定性有着非常重要的意义。

在日常的室内质控工作中，大多数的定量检验项目都采用Levey—Jennings图作为常规的质控方法。但L-J质控图通常需要作20次测定才可绘成，在此之前，不能对检测进行实时监控。因此对于类似CBA法检测细胞因子这类检测频次低，不能迅速进行质控数据积累的检验项目,迫切需要另一个能比较及时反映检测过程是否在控的质控方法。

“即刻法”是一种对离群值进行检验的统计方法，实质上是将数据处理过程中对异常值(即离群值)的判断及舍弃的方法[8]。其优点是只需要连续测定三次，即可对第3次及以后的数据进行在控与失控的判断，操作简单、易于掌握[8，9]。在本文中，我们运用“即刻法”分别监控IL-10、IL-8初期的质控数据，发现大部分的数据都未处于告警或失控，这说明检测过程在控，即刻法用于细胞因子实验的室内质控是可行的。在积累20个质控数据法后即转为L-J图后，我们发现IL-10即刻法数据虽未出现失控现象，但转化为L-J图后仍可发现第13点数为大于2s的警告状态，这说明“即刻法”有时并不能对告警或失控做到“实时”判断,所以其“即刻性”是相对的[8]。由于即刻法是从当天及以前的所有测定值中找出最大值和最小值，在室内质控时，测定次数较少时有些离群值可能不一定会显示失控，但随着测定次数的增加，测定值逐渐趋于稳定，这时以前的离群值将“暴露”出来显示为失控，对于这类数据值有的研究者被称之为“迟后异常值”[9]，这种现象被称为“回顾性失控检出”现象[10]，这是即刻法的一大缺陷。在IL-8的质控检测中我们还发现，即刻法第4组数据出现告警，而L-J图显示在控状态；而删除第4点后，又出现了第12点告警值，但仔细观察数据发现第11点数据（63.13）较第12点数据（43.55）偏离质控 均值 更远，出现了“距均值近的测定值被判告警,而距均值远的测定值在控”的不合理现象，有人[10]认为出现这种SI上限或SI下限值>n2S值时,说明该组测定值中最大值或最小值告警了,而并非末次测定值告警。因此，我们舍弃了即刻法出现告警的第4、20点数据以及实际超出了前10次累加计算在之外的异常值——第11点数据，补充了第21、22、23点数据后，重新计算均值和变异系数，显而易见，标准差变小，数据间离散程度（CV%)也变小了。

即刻法的另一不足之处，在于不能判断连续趋势性上升或下降失控。为了弥补这一不足，我们在检测20个点之后，计算出中心线和控制线，转入L-J法绘制质控图，使实验室工作人员能及时发现质控数据的失控情况，并能一目了然的判断质控数据出现上升或下降等趋势性变化，及时发现一些即刻法仍在控，而Levery-Jenning图可能已处于警告或失控范围的情况。

质控方法建立离不开持续性的改进：⑴“即刻法”只要3次检测结果就可开始质控，所以前3次的检测结果至关重要。据计算表明，若前3次检测结果允许的CV在5%以内时，第4个检测结果CV值>16%即失控；若前3次检测结果允许的CV>15%时，第4个检测结果CV值>40%远超室内质控允许的范围（≤30%）[11，12]。在本研究中IL-10前三点的CV值为7.72%，这有可能导致即刻法未能及时检出第13点警告值。因此在后续的检测中我们认为应重复前三次检测，将测定结果>均值+2SD或＜均值-2SD的数据剔除，以保证前3次结果的准确性和精密度；⑵由于CBA法操作过程繁琐，从样本处理、上机检测到数据处理都对实验者要求较高，每一步操作出现失误都会影响到结果[6]。因此实验前期我们建立了细胞因子测定的标准操作规程（SOP)，定期校准专用的加样枪，每次测定前都对流式细胞仪进行校准，尽量保证了每次实验条件的一致性。但临床工作中仍然发现有操作过程不规范，对质控方法理解不到位等情况，因此加强对实验室人员的操作培训,提高工作人员对即刻法质控的理解，也是预防性质控必不可少的一环。

综上所述，我们认为以“即刻法”可基本满足CBA法检测细胞因子的初始数据监控，在数据满20次后结合L-J图,可建立一个全面的质量管理体系,能确保试验结果的准确性和可靠性。