实时荧光PCR与DNA测序技术检测手足口病病毒结果分析

卢艳玲

（济源市疾病预防控制中心微生物检验科，河南 济源 459000）

手足口病是临床的多发病和常见病，具有较高的传染性和流行性，通常发生在夏秋季节，以5岁以下的婴幼儿最为常见。其中，以手、足部出疹，口腔黏膜疱疹或溃疡等为特征性表现[1]。一般情况下患儿在发病的5～7天自行缓解，也有少部分患儿会发展至重症，即在发病后的1～4天出现脑膜炎、脑炎、脊髓炎、脑脊髓炎等中枢神经系统受累并发症，甚至伴有肺水肿、肺出血及循环衰竭等症状。危重症患儿与轻症患儿不同，因其病情进展较快，，若不及时接受有效治疗，可危及生命安全。目前临床上诊断手足口病的金标准为病毒分离培养，虽然准确率高，但价格昂贵，检测时间长，对微生物实验室基础设备要求高，并不适合大规模推广，因此寻求一种操作简单、方便、费用低、准确率高、灵敏度高的检查方法十分必要[2]。有学者建议采用实时荧光PCR与DNA测序技术检测手足口病病毒，但国内对于它们的对比性研究较少，尚不清楚哪种方法的确诊率高。故本次对126例疑似感染手足口病患儿采用实时荧光PCR与DNA测序技术检测，探讨其对确诊率、敏感度、特异度的影响。报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 前瞻性选取2017年03月-2019年06月收治的126例疑似感染手足口病患儿进行研究，经病毒分离培养确诊为手足口病共92例，均给予实时荧光PCR与DNA测序技术检测。其中男性患儿62例、女性患儿64例；年龄范围2～11岁，平均5.71岁；病程范围3～7d，平均4.45d。

诊断标准：符合“手足口病诊疗指南(2018年版)”[3]诊断标准，譬如伴有口痛、厌食、低热及手足口等部位出现小疱疹等表现，经病毒分离培养确诊。

纳入标准：⑴经医院伦理委员会批准；⑵无药物禁忌症；⑶年龄大于或等于2岁；⑷家属同意参加本次研究；⑸无肺部感染性疾病。

排除标准：⑴伴有严重先天性心脏病；⑵哭闹情绪较为严重，无法配合操作。

1.2 方法 ⑴标本采集与制作：用无菌棉球采集本次所有受检者咽拭子标本，采集完毕后将其标本保存在采样瓶中，尽快倒入病毒保存液，在4℃的环境下保存及时送检。

⑵病毒分离培养：将所有采集的咽拭子标本接种到健康的单层RD细胞中，每份标本接种0.2ml，在33摄氏度的环境下培养；其次采用显微镜观察细胞，并记录细胞所发生的变化；若是在观察期间发生有特征的肠道病毒CPE出现，且高达70%左右，则将其储藏在-20℃的环境下以备二次传代；若是观察7d后无肠道病毒CPE出现，则应该盲传一代继续观察，盲传二代仍是没有出现肠道病毒CPE，则将其判定为阴性。

⑶实时荧光PCR检测：采用生理盐水对所有的标本重悬，再取1.5ml放置在无菌离心管中，并加入Trizol试剂200μl与氯仿100μl，通过振荡器离心振荡20s、静置3min后12000r/min冷冻离心2min，提取上清液，提取完毕后在上清液中加入10PLRNA提取液A，再次通过振荡器将溶液混合均匀，充分混匀后8000r/min冷冻离心1min，其目的是为了弃除上清液，而剩余的溶液放置在通风橱中，通风时间为15min，待瓶中出现白色沉淀物后加入DEPC 30μl，对其轻轻摇晃，待充分混匀后呈白色悬浊液进行PCR扩增；最后在PCR反应管中加入逆转录酶系2μl、Taq酶系3μL及RT-PCRl反应液5μl，加入完毕后再加入阴、阳性质控液与RNA标本悬浊液，其中PCR反应管总体积控制在25μl左右，8000r/min离心，待离心处理完毕后采用实时荧光PCR仪进行扩增检测。荧光PCR检测试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供。

⑷DNA测序：采用贝克曼DNA测序仪检测，病毒DNA提取试剂盒由西安天隆生物科技有限公司提供，按照说明书执行操作。

1.3 观察指标

1.3.1 评估实时荧光PCR检测与DNA测序的阳性预测值、阴性预测值。采用四格表法计算。

1.3.2 评估上述方法对手足口病毒亚型的检出情况，包括肠道病毒通用型（EV）检出率、肠道病毒71型（EV-71）检出率、柯萨奇病毒A16（CA-16）。

1.3.3 评估上述方法的准确率、漏诊率、误诊率。

1.3.4 评估实时荧光PCR、DNA测序技术诊断手足口病的AUC、敏感度、特异性及约登指数。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0软件分析本次数据。计量资料用（）表示，行独立样本t检验；计数资料用（n；%）表示，行χ2检验；诊断价值采用ROC曲线分析；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 手足口病病原体分型 在126例疑似感染手足口病患儿中，经病毒分离培养确诊为手足口病共92例、百分比为73.02%；其中，检出为EV病毒共48例、百分比为52.17%，检出EV-71病毒共32例、百分比为34.78%，检出CA-16病毒共16例、百分比为17.39%。

2.2 实时荧光PCR的阳、阴性预测值分析126例疑似感染手足口病患儿经实时荧光PCR检测后阳性预测值为96.77%、阴性预测值为93.94%；与金标准齐同（P＞0.05）。见表1。

表1 实时荧光PCR的阳、阴性预测值比较

2.3 DNA测序技术的阳、阴性预测值分析126例疑似感染手足口病患儿经DNA测序技术检测后阳性预测值为83.53%、阴性预测值为48.78%；低于金标准（P＜0.05）。见表2。

表2 DNA测序技术的阳、阴性预测值比较

2.4 手足口病毒亚型的检出情况126例疑似感染手足口病患儿经实时荧光PCR检查后确诊为手足口病共90例，其中感染EV病毒47例、EV-71病毒31例、CA-16病毒12例；经DNA测序技术检查后确诊为手足口病共71例，其中感染EV病毒38例、EV-71病毒20例、CA-16病毒13例。见表3。

表3 不同检查方法对手足口病毒亚型的检出情况（n；%）

2.5 准确率、漏诊率、漏诊率比较 实时荧光PCR的准确率高于DNA测序技术，而误诊率、漏诊率低于DNA测序技术（P＜0.05）。见表4。

表4 两种检查方法的敏感度、特异度、准确率比较（n；%）

2.6 ROC曲线分析ROC曲线分析显示，实时荧光PCR、DNA测序技术诊断手足口病的AUC分别为（0.945、0.680，P＜0.05）；依据AUC及标准误，采用Z检验AUC差异，结果显示实时荧光PCR VS DNA测序技术Z=4.171、P＜0.001；其中敏感度分别为97.80%、77.20%，特异度分别为91.20%、58.80%。见表5，ROC曲线见图1。

表5 诊断效能分析

图1 实时荧光PCR与DNA测序技术的ROC曲线分析

3 讨论

手足口病是一种急性传染病，由多种肠道病毒感染所引起，譬如柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型等病原体[4]。经调查发现，肠道病毒71型会导致患儿发生中枢神经系统病变，如脑膜炎、脑脊髓炎等，甚至因中枢神经系统、循环系统、呼吸系统损害而死亡[5]。基于此，尽早诊治显得十分重要，对控制病情发展及挽救患儿生命安全具有重要意义。目前临床上针对该病，多采用病毒分离培养、DNA测序技术、实时荧光PCR等方法检测。其中，第一种方法为临床诊断手足口病的金标准，虽然诊断确诊率较高，但因检测周期长，无法满足早诊断、早治疗的目标[6]。第二种方法是分子生物学研究中最为常用的技术之一，尽管测序法可达到一定通量，但因设备特殊、昂贵、操作步骤繁琐及结果判读复杂，对环境和操作者要求高，导致该项检查无法大规模推广。而第三种是通过检测手足口病患儿的咽拭子、粪便等标本，行病原体诊断，具有操作简单、方便、稳定性良好等特点[7]。另外，它也是一种新兴的分子生物检测方法，通过在线实时监测，避免人为判断[8-10]。

研究结果显示，126例疑似感染手足口病患儿经实时荧光PCR检测后，其阳性预测值为96.77%显著高于DNA测序技术检测后的阳性预测值；并且实时荧光PCR检测的阳性预测值较接近“金标准”，提示实时荧光PCR诊断确诊率更高。其中，DNA测序技术阳性预测值较低可能与病毒缺失有关，加上基因突变图谱复杂，导致标本需在基因克隆的前提下，确定其突变类型，否则难以检测到病毒[10-12]。在敏感度、特异性及准确率方面，本研究发现实时荧光PCR更高，但也存在假阴性情况，即假阴性出现3例；为了避免该情况的发生，建议在实时荧光PCR检测结束后，将PCR产物放置在2%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现扩增产物，则可排除假阴性的可能[13]。另外，实时荧光PCR所采用96孔板实时PCR仪器，同时能检测48个标本，甚至更多，且检测时间较短，能在2h内完成；而DNA测序技术无法做到，需要进行扩增、纯化、序列分析等步骤，故耗时较长[14,15]。并且检测费用及其成本比实时荧光PCR高，故本文更建议采用实时荧光PCR检测方法，在其ROC曲线分析中，发现实时荧光PCR的AUC值高于DNA测序技术，提示前者诊断价值更高。

综上所述，实时荧光PCR与DNA测序技术检测相比，前者更加快捷，且灵敏度、特异度更高，能满足临床需求。