湿地植物节节木贼和条穗苔草根际溶镉微生物筛选及其促生特性研究

唐志远刘可星陈金峰

(1.佛山市新城园林绿化工程有限公司，广东 佛山 528315；2.华南农业大学资源环境学院，广东 广州 510640；3.广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东 广州 510640)

重金属镉污染是许多国家面临的一个比较严重的农业土壤污染问题，已成为一个全球性的环境问题，具有毒性大、长期性和难修复等特点。我国农田镉污染较为严重，据测算，我国耕地土壤重金属污染概率为16.67%，约占我国耕地总面积的1/6，其中镉的污染概率为25.20%，远超过另外7种重金属(砷、锌、铬、汞、铜、镍和铅)[1]。生长在镉污染耕地里的农作物吸收富集重金属，造成农产品重金属含量超标，长期食用镉超标的农产品，会造成大量的镉在人体富集，破坏人体正常的生理生化机能，甚至导致癌症[2]。

耕地镉污染对食品质量安全和人们健康造成了巨大的威胁，亟待修复。当前，重金属镉污染土地的修复方法主要有物理法、化学法和生物法3大类，常规的物理或化学方法往往见效快，但是存在成本高、二次污染等问题，难以用于大规模的重金属污染地修复[3]。近半个世纪以来，世界各地陆续发现一些植物可在体内大量富集重金属，这类植物被称为超富集植物，通过人为收割即可永久性地将土壤中的重金属去除[4]。采用这种植物修复的方法提取土壤中的重金属具有低成本、易操作,不会对土壤造成破坏等优点[3]，日益受到广泛的关注，但是却遇到了植物生物量低、提取量不大和植物根际重金属生物有效性低等问题[5]。

通过土壤微生物的代谢活动促进超富集植物的生长，增加植物根际重金属生物有效性，成为近年来强化植物提取效率的重要研究方向。研究发现，土壤细菌可通过多种途径，如分泌有机酸、降低土壤pH值、溶解或螯合重金属等方式，提高土壤中的金属迁移率或生物有效性；土壤细菌也可通过分泌植物生长激素、合成ACC脱氨酶(一种有效降低逆境胁迫下乙烯含量的酶)、溶解土壤磷等方式，增加植物营养供给，促进植物生长[6]。近年来，拥有重金属溶解或植物促生能力的菌株不断被发现。如，夏娟娟等[7]从菜园土壤中筛选获得了分属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)的2株细菌，发现2株菌均能够显著增加土壤中重金属镉的有效性，加菌情况下土壤有效镉比对照分别增加了17.02%～100%和36.17%～61.80%。蒋淼等[8]从龙葵根际分离到了4株细菌(Lysinibacillus sp.、Beijerinckia fluminensis、Achromobacter animicus和Herbaspirillum huttiense)，能通过分泌生长素IAA或产铁载体或溶解土壤磷等方式促进植物生长，从而增强植物重金属修复效率。

植物根际环境存在大量代谢活跃的微生物群落，是天然的筛选溶镉或促生菌的资源库。本研究对重金属镉污染地区的湿地植物群落根际土壤中的微生物进行了筛选，以期获取既能够溶解重金属又能促进植物生长的微生物资源，用以协助植物修复重金属镉污染土壤，增强植物修复的效率。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

重金属污染土壤(MT)取自广东省河源市连平县境内锯板坑矿区附近忠信河河岸湿地植物群落根际。湿地植被群落以节节木贼(Equisetum ramosissimum)和条穗苔草(Carex nemostachys)混生群落为主。土壤的基本理化性质如表1。

1.2 培养基和试剂

1.2.1 培养基

低磷有氮固体培养基：蔗糖10g，(NH4)2SO41.0g，K2HPO40.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃下湿热灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃下湿热灭菌20min。

菌株初筛培养基：CdSO4·8H2O配成10g·L-1的溶液,单独灭菌,然后与低磷有氮固体培养基混合倒平板，重金属Cd浓度为50mg·L-1。

菌株复筛培养基：称取CdCO30.1g，加入100mL低磷有氮液体培养基中，pH 7.2，121℃下湿热灭菌20min。

磷酸钙培养基：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，Ca3(PO4)210.0g，蒸馏水1.0L，pH值7.0，121 ℃灭菌20min。

改良蔗糖-天冬氨酸培养基(Modified sugar-aspartic acid,MSA)：蔗糖20.0g，L-天冬氨酸2.0g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1000mL，调节pH为7.0，121℃下湿热灭菌20min。

低盐蔗糖培养基(Sucrose minimal salts,SMS)：蔗糖10g，(NH4)2SO41g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母提取物0.5g，CaCO30.5g，NaCl 0.1g，pH 7.2，121℃下湿热灭菌20min。

加色氨酸的SMS培养基：添加0.5mg·mL-1的色氨酸，其余成分一致。

液体培养基为固体培养基不添加琼脂，其余成分一致。

1.2.2 试剂

CdCO3、Ca3(PO4)2、铬天青S、十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)、吲哚-3-乙酸(3-IAA)为分析纯。有机酸标准品(草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、冰乙酸、柠檬酸、丁二酸)均为分析纯。

铬天青S(CAS)检测液：称取0.079g CAS溶于50mL蒸馏水中，再加入10mL 1mmol·L-1的FeCl3溶液(溶剂为0.1mol·L-1的稀盐酸)，记作溶液A。称取0.069g十六烷基三甲基溴化铵溶于40mL蒸馏水中，记作溶液B。将溶液A沿烧杯壁缓缓加入溶液B中，搅拌混匀即得CAS检测液。

PC比色液：称取FeCl312g溶于300mL蒸馏水,然后缓慢加入429.7mL的浓H2SO4(质量分数98%)，待冷却后定容至1L,测定范围0.3～20mg·L-1。

S2比色液：称取4.5g FeCl3溶于300mL蒸馏水,然后缓慢加入587.4mL质量分数98%的浓H2SO4，待冷后定容至1L，测定IAA范围5～200mg·L-1。

Salkowski’s显色剂:150mL浓硫酸溶于250mL蒸馏水中，加入7.5mL 0.5mol·L-1的FeCl3溶液(溶剂为0.1mol·L-1的稀盐酸)。

1.3 耐镉菌株筛选与种子液制备

称取10g土壤加入100mL低磷有氮液体培养基中，在30℃，200rpm条件下摇床培养2h，静置30min。用移液枪移取100μL土壤悬液，用涂布棒将土壤悬液均匀涂布在含有50mg·L-1Cd初筛培养基上，涂布完成后，平板放置3min，在恒温培养箱中30℃倒置培养2d，待长出菌落后在平板上挑取分离较好、生长丰满的细菌单菌落，在含有Cd浓度50mg·L-1的初筛培养基上划线纯化直至出现单菌落，镜检，转至斜面4℃保存，获得耐镉菌株。

将耐镉菌株用牛肉膏蛋白胨固体培养基活化18h后，挑取菌株到牛肉蛋白胨液体培养基中，于30℃条件下150rpm摇床培养18h，获得菌株的种子液。

1.4 不同菌株溶镉能力测定

将耐镉菌株的种子液以1%的接种量加入装有100mL复筛培养基中,同时设1%无菌液体培养基作为对照。每个处理设3个重复。30℃下，150rpm培养48h。培养结束后，将培养液在5000r·min-1条件下离心10min,取上清液，0.45μm滤膜过滤。用TAS-986原子吸收仪测定滤液中镉浓度，评价耐镉菌株的溶镉能力，获得溶镉能力强的菌株。

1.5 溶镉能力强菌株产有机酸测定

将溶镉能力强的菌株的种子液以1%的接种量接入100mL低磷有氮培养基中,同时设1%无菌液体培养基对照。每个处理设置3个重复。30℃下，150rpm培养48h后,测定培养液pH，在5000r·min-1下离心10min,取上清液，用0.45μm滤膜过滤，参照秦忠雪等[9]研究方法用高效液相色谱法测定滤液中草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、冰乙酸、柠檬酸、丁二酸的含量。

1.6 溶镉能力强菌株溶磷能力测定

将溶镉能力强的菌株种子液以1%的接种量接入100mL磷酸钙培养基中,同时设1%无菌液体培养基对照。每个处理设置3个重复。置于30℃摇床上，150r·min-1振荡培养3d后，将发酵液转移至离心管中，在5000r·min-1条件下离心10min,取上清液，采用钼锑抗比色法测定上清液中磷浓度。

1.7 溶镉能力强菌株产铁载体能力测定

将溶镉能力强的菌株种子液以1%的接种量接入100mL MSA液体培养基中,同时设1%无菌液体培养基对照。每个处理设置3个重复。30℃、150r·min-1条件下培养2d，5000r·min-1离心15min，移取上清液4mL加入4mL CAS检测液，充分混匀，于25℃下静置1h，用双蒸水作参比，于波长630nm处测定样品的吸光值(As)和对照的吸光值(Ar)。按照铁载体活性单位SU的定义(SU=[(Ar-As)/Ar]×100)，计算不同菌株的As/Ar。依据计算结果对细菌产铁载体能力进行划分：As/Ar以0.2为间隔，从1.0～0每减小0.2增加一个加号，加号越多表示产铁载体能力越强。

1.8 溶镉能力强菌株产生长素IAA能力测定

将溶镉能力强的菌株的种子液以1%的接种量接入100mL添加色氨酸或不添加色氨酸的SMS液体培养基中,同时设1%无菌液体培养基对照。每个处理设置3个重复。置于30℃摇床上，150r·min-1振荡培养3d后，将发酵液转移至离心管中，在5000r·min-1条件下离心10min,上清液在4℃保存备用。

以3-IAA配制2组IAA标准溶液：第1组浓度依次为2.5mg·L-1、5.0mg·L-1、7.5mg·L-1、10.0mg·L-1、12.5mg·L-1、15.0mg·L-1、17.5mg·L-1；第2组浓度依次为25mg·L-1、50mg·L-1、75mg·L-1、100mg·L-1、125mg·L-1、150mg·L-1、175mg·L-1。分别取4mL，在第1组中加入等量的PC比色液，在第2组中加入等量的S2比色液，黑暗静置30min，取出立即用分光光度计测定OD530，重复3次，制作标准曲线。

将4mL上清液和4mL Salkowski’s显色剂混合后放置在黑暗中30min，以添加比色液的空白对照调零，在530nm处读取显现的粉红色的吸光度，根据PC比色液和S2比色液所测定的浓度范围，选用相应的标准曲线，确定待测菌株分泌IAA的量。

1.9 菌株16s rDNA测序

菌株送至广州基迪奥生物科技有限公司测定16s rDNA基因序列。

1.10 数据统计分析

以Microsoft Excel和IBMSPSSStatistics 22处理试验数据，Microsoft Excel和Origin 9.0绘制图表。

2 结果与分析

2.1 重金属镉耐受菌株筛选

从节节木贼和条穗苔草群落根际土壤中共筛选得到6株菌，分别命名为MT15、MT16、MT17、MT18、MT19、MT20，6株菌均能在镉浓度为50mg·L-1的低磷有氮培养基上生长。

2.2 菌株镉溶解能力

菌株MT18、MT19和MT20有溶解CdCO3的能力，菌株MT15、MT16和MT17不具备溶镉能力。菌株MT18、MT19和MT20对培养基中CdCO3的溶出率高达65%～75%，使得溶液中存在高浓度的Cd2+(433.67～517.07mg·L-1)。3株溶镉菌的溶镉能力相当，其中MT19的溶镉能力最强，见表2。

表2 不同菌株溶镉能力

2.3 菌株有机酸分泌能力

对具有溶镉能力的3株菌MT18、MT19和MT20分泌有机酸的情况分析发现，3株菌均能够分泌草酸、乙酸和柠檬酸，MT18和MT19能够生产乳酸，未在3株菌的培养液中检测到酒石酸和丁二酸。3株菌均以乙酸的产量最高，其次是柠檬酸、乳酸和草酸。不同菌株分泌有机酸的量有差异,乙酸和柠檬酸分泌量，菌株MT18>MT19>MT20，草酸分泌量MT19大于其它2株菌。3株菌均能够使培养液pH大幅下降，见表3。

表3 不同菌株间分泌有机酸含量及溶液pH

2.4 菌株溶磷效果

3株菌的溶磷能力如图1所示，3株菌均能溶解大量的磷，溶液中磷的浓度均在500mg·L-1以上，其中MT20溶解磷的能力最强。

图1 不同菌株溶磷能力

2.5 菌株产铁载体能力

3株菌产铁载体能力如表4所示。3株菌均具有产铁载体活性，其中MT18的活性最高41.63%，产铁载体能力最强。

表4 不同菌株铁载体产生能力

2.6 菌株产IAA含量

3株菌产IAA的情况如图2所示。在无色氨酸补充时，仅有MT19和MT20能够产生IAA；在添加色氨酸情况下，3株菌均能产生IAA，而且产量普遍高于无色氨酸条件，其中MT20分泌IAA的能力最强。

图2 不同菌株产IAA能力

2.7 菌株鉴定

对3株溶镉菌中分泌IAA和溶磷能力比较强的MT20进行了16s rDNA测序分析，发现MT20与肠杆菌属细菌(Enterobacter sp.)有99.66%的相似度。

3 讨论

植物根际是各种土壤微生物最为活跃的微环境，植物根系分泌物为微生物提供碳源或者调控微生物的生理活动，微生物又通过代谢产物与植物根系相互作用，共同造就生化、生理和生态过程极为复杂的根际微环境。研究植物根际的微生物，揭示根际微生物与植物之间的相互关系及其形成原理，对于污染环境修复、农业生产等具有重要意义。本研究从重金属污染矿区的湿地植物群落根际中筛选得到3株能够溶解重金属、分泌有机酸、溶磷、分泌铁载体和生长素IAA的菌株。其中MT20经16s rDNA鉴定为肠杆菌属细菌。

肠杆菌属的一些菌株已被证明具有明显的促生能力。Kim等[10]从日本石竹(Dianthus japonicus thumb.)根际筛选了一株肠杆菌(Enterobacter sp.EJ01)能够分泌IAA、ACC脱氨酶，调节植物基因表达，提高活性氧清除能力，增强番茄(Lycopersicon esculentum var.Mill)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)抗盐胁迫能力。Jetiyanon[11]报道了一株在泰国发现的能够促进黄瓜、番茄和辣椒等多种作物生长的肠杆菌细菌(Enterobacter asburiae strain RS83)，具有类似的分泌IAA、溶磷、产铁载体、固氮等生理生化性状。Pramanik等[12]从重金属污染地水稻根系分离到了一株肠杆菌(Enterobacteraerogenes MCC 3092)表现出分泌IAA、固氮、溶磷、合成ACC脱氨酶等特性，并能显著提高植物抗逆性，促进重金属胁迫下水稻生长。可见，肠杆菌属细菌可能具有增强植物在逆境下抗胁迫、促进植物生长的能力，这对于修复重金属污染土壤尤为重要。

一些肠杆菌属的细菌也被报道具有增强植物根际重金属有效性的能力。如，Enterobacter sp.FM-1能够增加积雪草(Centella asiatica)、水蓼(Polygonum hydropiper)和酸模叶蓼(Polygonum lapathifolium)根际生物有效态镉的含量，并推测Enterobacter sp.FM-1的这种能力可能与其分泌铁载体、降低根际环境pH等性状有关[13,14]。

本研究筛选到的肠杆菌MT20均具有类似于Kim等[10]、Pramanik等[12]和Li等[13,14]报道的性状，可推测MT20具有促进植物修复重金属植物的潜力，但是在实际修复实践中，植物的修复效率还受到土壤类型、植物种类和接种菌剂量的影响，因此MT20等微生物的具体促生促修复效果有待进一步试验研究。

4 结论

重金属污染区湿地植物根际存在具有溶镉和促生潜力的微生物。本研究筛选获得了6株耐镉菌株，其中有3株(MT18、MT19和MT20)能够分泌草酸、乙酸和柠檬酸等有机酸，降低溶液pH，溶解碳酸镉和磷酸钙，产生溶镉溶磷效果。此3株菌也均能分泌铁载体和IAA，因而具有促生潜力。经16s rDNA鉴定，MT20为肠杆菌属细菌。