不同的样品前处理方式在氯霉素残留快速检测中的应用情况探讨

张家意丘韶麟陈苑廖玮

(1.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442；2.广东省食品质量监督检验站，广东 广州 511442； 3.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442)

引言

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一种广谱抗菌药物，对大部分细菌有抑制、杀菌作用。正因其抑菌性强、药效佳，氯霉素曾在水产、畜禽养殖业中被广泛使用，使得养殖业产业稳定增益。从应用演化成滥用，氯霉素残留对动物、人体都有着极大危害，至今仍威胁我国水产品的安全，危害着产业发展和群众生命健康的同时也对我国国际地位造成影响。根据农村农业部第250号公告[1]《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》，严禁氯霉素药物在动物源食品中使用，可见政府对违禁药物的监管力度大，也从侧面表现问题的严峻性。2016年高裕锋等[2]对广东省部分地区市场销售的150批次水产品进行氯霉素残留情况调查，调查结果显示，氯霉素检出率为11.33%。2019年宋安华等[3]对广州市农贸市场抽检的2702批次水产品进行快筛分析，分析结果得出，虾类的氯霉素残留不合格率达到17.39%。

目前，最常见检测氯霉素残留的方法有微生物法、免疫分析法、色谱法、串联质谱法，以及新型技术，如分子印迹法、电化学传感器、生物芯片法、拉曼光谱等[4]。其中，免疫分析法主要包括酶联分析法(ELISA)、胶体金免疫分析法(GICA)等。国家市场监管总局发布的2019年第41号公告[5]《保健食品中西地那非和他达拉非的快速检测 胶体金免疫层析法》等13项食品快速检测方法里发布了《KJ201905水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法》。胶体金免疫层析法是应用于快速快筛方法和产品中最多的快检技术，其优点在于特异性强、灵敏度高、检测时间短，适用于现场大批量样品的筛查检测。随着国家推动快速检测方法，对快速检测工作的规范管理要求也在不断提高。李涛等[6]对于水产品中氯霉素快速检测产品的验证性评价及分析中表明，通过对氯霉素快速检测试剂盒进行技术指标的评价，符合要求的适宜在现场实际监管中推广使用。

胶体金免疫层析法也存在缺点，产品性能方面，会出现假阳性、假阴性的现象；产品呈现效果方面，会出现显色效果不佳、断线影响结果判断等。因此，此方法对于样品基质的适用性和前处理方法仍需要不断改进。本次实验是通过使用符合国家规定的快速检测方法以及性能评价符合规范要求的快检产品来完成水产品中氯霉素残留的快检实验，在氯霉素快检试剂盒产品说明书规定的操作步骤基础上通过2种不同的样品前处理方式，分别在样品提取前、净化后进行改良，观察胶体金卡实验结果的呈现效果，以使基层快检员在使用胶体金免疫层析法检测氯霉素残留的过程中能够提高使用效果，对可能存在基质干扰样品的检测结果判读更有把握。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器设备

氯霉素标准品(1mg·mL-1，北京曼哈格生物科技有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，美国霍尼韦尔B&J公司)；氯霉素残留检测试纸条(内含试剂及检测卡，北京勤邦生物技术有限公司)。

捣样机(JYL-C020E，九阳)；电子天平(AR323CN，奥豪斯仪器有限公司)；旋涡混合器(MS3 basic S025，德国IKA公司)；离心机(2-4，上海拖莫斯科学仪器有限公司)；样品浓缩仪(Pro-12L，南京百思威科技发展有限公司)；单道手动可调移液器(20～200μL、1～5mL，芬兰biohit实验室仪器有限公司)；恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 快检试剂盒的选择

本实验所使用的快检试剂盒氯霉素残留检测试纸条为广东省市场监督管理局发布《食品快速检测已评价产品目录》中的合格快检产品，产品标示检出限0.1μg·kg-1。

1.3 2种前处理方式

原提取和脱脂提取。

1.4 实验过程

1.4.1 样品的选取及制备

本次实验的样品共3种，分别是牡蛎(生蚝)、鳙鱼(大头鱼)、猪肉。获取方式是在当地不同农贸市场所销售的产品中进行随机采购，采购数量要同时满足快检实验及本次实验需求。

每种样品经过去头、去皮、去内脏，取可食部位约100～150g，用捣样机均匀绞碎，绞碎后的样品冷冻保存备用。

1.4.2 提取

1.4.2.1 原提取

称取1.4.1制备好的样品2.00g(±0.01g)置于15mL离心管中，加入4mL提取剂(乙酸乙酯)；使用旋涡混合器涡动2min后，4000r·min-1离心5min。

1.4.2.2 脱脂提取

把1.4.1制备好的样品放置玻璃烧杯中，加入石油醚，浸没过杯中样品高度，使用玻璃棒让样品与石油醚混匀反应；开启水浴锅，温度调至60℃，把石油醚与样品混匀后的样品烧杯放在水浴锅孔上，让石油醚充分挥发。

1.4.3 浓缩

移取3mL上层有机相至10mL离心管中，再置于50～60℃的样品浓缩仪通过氮气流或空气流下吹干。

1.4.4 复溶

向吹干的试管中依次加入0.2mL样本复溶液(磷酸盐缓冲液)，用旋涡混合器涡动2min充分混匀，使试管内壁上的残留物溶解，静置后待测。

1.4.5 测定

从原包装中取出氯霉素快速检测试纸条，吸取75μL样品待测液于试纸条的加样孔中，液体流动时开始计时，反应10min，根据结果示意图进行判读。从原包装中取出的氯霉素快速检测试纸条使用时应回温至室温，并在1h内使用。

1.4.6 判读

通过对比试纸条的控制线(C线)和检测线(T线)的颜色深浅进行结果判读。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判读，结果判读分3种情况。阴性(-)：检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色深或者检测线(T线)颜色与控制线(C线)颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，见图1。阳性(+)：检测线(T线)不显色或检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，见图2。无效：控制线(C线)不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效，见图3。

图1 阴性结果图 图2 阳性结果图 图3 无效结果图

2 实验结果

通过使用氯霉素快速检测试纸条分别按照2种方法对本次3种基质的样品分别完成了3组(每组4份)的快速检测实验，添加氯霉素标准品到各组分样品中，添加浓度分别是0μg·kg-1、0.05μg·kg-1(0.5倍检出水平)、0.1μg·kg-1(1.0倍检出水平)，每个浓度做2个平行样。具体结果见表1。

表1 实验结果汇总

3 结论

3种基质的样品使用原提取或脱脂提取进行前处理得出的实验结果均能符合说明书的判定要求，通过添加对应浓度的标准物质得出的阴阳性实验结果均能达到试剂盒标示的检测水平要求。

原提取的样品点板效果比经过脱脂提取后的样品点板效果要好，具体体现：C/T线颜色较深，2条线对比较为明显，易于结果判定；C/T线不易出现断线情况，不容易影响结果判定；即使过了有效判定时间，结果也不会改变。

石油醚是低沸点烷烃组成的非极性有机溶剂，加入样品后可以与动物中的脂肪酸互溶，石油醚沸点较低，容易挥发，故可以通过加入石油醚至样品中进行脱脂。脱脂后的样品再按照试剂盒说明书进行检测，可以提高判定结果的准确度。