东莨菪内酯对高脂饲料诱导的肥胖小鼠脂质代谢的影响

金亮华， 刘官成， 王龄鹤， 闫姿安， 许唱,3， 元海丹,3*

(1.延边神圣制药有限公司；2.延边大学 药学院；3.延边大学长白山天然药物研究教育部重点实验室；4.延边大学 融合学院: 吉林 延吉 133002)

肥胖是一种由多因素引起的慢性代谢性疾病，通常表现为脂肪在体内分布异常或堆积过多，进而导致体重增加.研究表明，肥胖容易导致高血脂症、心血管疾病以及糖尿病等代谢疾病，现已成为全球重大公共卫生问题之一[1-2].东莨菪内酯(6-甲氧基-7-羟基香豆素)是存在于多种植物(如丁公藤(ErycibeobtusifoliaBenth.)[3]、紫花地丁(ViolaPhilippica.)[4]、茵陈蒿(Artemisiacapillaris)[5]、白芷(AngelicaeDahuricaeRadix)[6]、诺丽果[7]、红薯[8]等)中的一种活性物质，具有抗炎[9]、抗肿瘤[10]、抗氧化[11]、降血压[12]和降血糖[4]等多种药理作用.目前，关于东莨菪内酯对调节脂肪代谢方面的研究较少，如东莨菪内酯对脂肪肝的抑制作用虽已被证实，但其相关作用机制尚不完全清楚[13-15].为了进一步阐明东莨菪内酯对小鼠脂肪代谢的调节机制，本文利用由45 kcal%高脂饲料(HFD)-诱导的肥胖小鼠模型探究东莨菪内酯对肥胖小鼠脂肪积蓄的抑制作用及其机制.

1 材料与仪器

1.1 实验材料

40只雄性ICR(institute of cancer research)小鼠(4周龄，体重为18～20 g)，长春亿斯实验动物技术有限公司；东莨菪内酯，东京化成工业株式会社；水飞蓟素、羧甲基纤维素钠、中性甲醛固定液、油红O、苏木素(hematoxylin，H)、伊红(eosin，E)、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、溴化乙锭、异氟烷，Sigma-aldrich公司；O.C.T(optimal cutting temperature compound)冷冻切片包埋剂，Tissue Tek公司；中性树胶、甘油明胶，Merck公司；甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；总RNA提取试剂盒，iNtRON公司；M-MLV第一链cDNA合成试剂盒，Promega公司；ExTaq酶，大连宝生物工程有限公司；SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ和aP2引物，上海Bioneer公司；琼脂糖凝胶，Bio-rad公司；甲醇、乙醇、异丙醇、二甲苯、乙醚等均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司.

1.2 实验仪器

分析天平，上海精天电子仪器有限公司；低速离心机，Eppendorf公司；多功能酶标仪，Tecan公司；组织匀浆机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；冰冻切片机，Leica公司；倒置显微镜，Olympus公司；恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器厂；酸度计，上海奥豪斯仪器有限公司；-80 ℃超低温冰箱，Sanyo公司；电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；凝胶成像仪，UVP公司.

2 实验方法

2.1 实验动物分组与给药方法

将40只适应环境1周后的小鼠随机分为5组(正常对照组(CON)、模型组(HF)、东莨菪内酯高剂量组(HFH)、东莨菪内酯低剂量组(HFL)和阳性对照组(水飞蓟素，HFS))，每组8只.正常组饲以10 kcal%饲料，其他组均饲以45 kcal% HFD.共喂养小鼠13周，且在最后4周中每天灌胃给药1次，其中CON组和HF组为质量分数为0.5%的羟甲基纤维素钠溶液，HFH组和HFL组分别为20 mg/kg和10 mg/kg的东莨菪内酯，HFS组为30 mg/kg的水飞蓟素.喂食前，东莨菪内酯和水飞蓟素分别用质量分数为0.5%的羟甲基纤维素钠溶液溶解.

2.2 血液指标的测定

给药过程结束后，用异氟烷对小鼠进行麻醉，并以心脏穿刺法取全血.全血离心15 min(3 000 r/min，4 ℃)后取血清，然后再分别按照TG、TC试剂盒的操作说明进行操作.

2.3 组织病理学观察

解剖小鼠，采集肝脏、肩胛骨棕色脂肪及白色附睾丸脂肪组织后，再取适当大小的组织分别用冷冻切片包埋剂包埋；用冷冻切片机将组织切成5 μm厚度的切片，然后对切片进行H&E染色和油红O染色；完成染色后，在光学显微镜下观察各染色切片组织的病理学变化.

2.3.1肝脏组织和脂肪组织的H&E染色

分别将切好的肝脏组织切片和附睾丸中的白色脂肪组织切片放入乙醚-乙醇溶液(V(乙醚)∶V(乙醇)=1∶1)中固定1 min，然后水洗(1 min)、H染色(肝脏组织1 min，附睾丸白色脂肪组织20 s)；水洗3 min后进行E染色(肝脏组织2 min，附睾丸白色脂肪组织40 s)；自来水冲洗10 min后用梯度乙醇(体积分数分别为70%、80%、90%、95%)进行脱水，然后用二甲苯溶液浸泡3 min后用中性树胶封片.

2.3.2脂肪组织的油红O染色

将切好的肝脏组织切片在室温下用体积分数为10%的中性甲醛固定液固定5 min，然后用水冲洗10 min；在体积分数为60%的异丙醇溶液中浸泡5 min后用油红O溶液染色5 min，然后再用体积分数为60%的异丙醇调色3 min；自来水冲洗3 min后进行H染色(3 s)，然后再用自来水冲洗5 min后用甘油明胶封片.

2.4 RT-PCR实验

首先，采用Trizol一步法[16]提取小鼠白色附睾丸脂肪组织中的总RNA，并采用M-MLV第一链cDNA合成试剂盒完成逆转录反应.然后，以合成的cDNA为模板，按照RT-PCR操作步骤对cDNA进行PCR扩增.PCR的反应条件为：95 ℃预变性60 s，30个循环(每个循环为95 ℃变性5 s)，50 ℃(FAS)、55 ℃(PPAR-γ)、56 ℃(SCD1，SREBP-1α)、57 ℃(CPN)、60 ℃(aP2)退火30 s，72 ℃下延伸30 s.在72 ℃下继续反应10 min，然后将样品在4 ℃下放置1 h.在100 V恒定电压下用质量分数为1%的琼脂糖凝胶(含0.01%溴化乙锭)对样品进行电泳，并用凝胶成像系统对凝胶进行扫描和拍摄.RT-PCR的引物序列见表1.

表1 RT-PCR的引物序列

2.5 统计学分析

采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析.实验数据以均数±标准偏差(mean±S.D)表示，两组样本比较采用t检验，以P< 0.05为有统计学意义.

3 结果与分析

3.1 东莨菪内酯对小鼠血液指标的影响

表2为ICR小鼠的血液指标.由表2可以看出：与CON组相比，HF组小鼠的TG和TC水平分别增高了98.8%和38.6%；与HF组相比，HFH组和HFL组的TG水平呈剂量依赖性地显著降低了47.0%和26.2%，TC的水平呈剂量依赖性地降低了17.0%和5.3%.以上结果说明，东莨菪内酯对HFD-诱导的小鼠血脂水平具有良好的改善作用.

3.2 小鼠脂肪组织的病理形态学观察

为了观察东莨菪内酯对HFD-诱导的肥胖小鼠脂肪积蓄的抑制作用，对小鼠肝脏组织的冰冻切片进行H&E染色和油红O染色，对小鼠的肩胛骨棕色脂肪组织和白色附睾丸脂肪组织的冰冻切片进行H&E染色，结果如图1所示.由图1可以看出，在CON组小鼠的肝脏组织中无明显的脂滴存在，而在HF组小鼠的肝脏组织中存在较多的脂滴；东莨菪内酯给药组和HFS组小鼠肝脏组织中的脂滴数量比HF组小鼠肝脏组织中的脂滴数量显著减少，且东莨菪内酯给药组小鼠肝脏组织中的脂滴数量明显少于HFS组.上述结果说明，东莨菪内酯可剂量依赖性地抑制HFD-诱导的肥胖小鼠的脂肪在肝脏中的积蓄.

图1 东莨菪内酯对小鼠肝脏组织的病理形态学影响(放大倍数×200)

图2(A)为小鼠肩胛骨脂肪组织(棕色)和附睾丸脂肪组织(白色)的H&E染色结果.由图2(A)可以看出，与CON组小鼠的单个脂肪细胞的面积相比，HF组小鼠的单个脂肪细胞的面积明显增大，而东莨菪内酯给药组及HFS组小鼠的单个脂肪细胞的面积有所减小，且东莨菪内酯给药组小鼠的单个脂肪细胞的面积小于HFS组小鼠的单个脂肪细胞面积.图2(B)为对白色附睾丸脂肪组织的细胞大小进行统计的结果.从图2(B)可以看出：在CON组中，附睾丸脂肪组织的细胞直径小于400 μm的比例占总细胞数的96.4%.在HF组中，附睾丸脂肪组织的细胞直径大于400 μm的比例占总细胞数的31.5%，而直径小于200 μm的细胞比例低于总细胞数量的13.5%.在HFH组中，附睾丸脂肪组织的细胞直径大于400 μm的比例低于总细胞数量的1.8%，而直径小于200 μm的比例高于总细胞数量的53.6%.在HFL组及HFS组中，附睾丸脂肪组织的细胞直径大于400 μm的细胞比例分别占总细胞数量的26.3%和30.1%，而小于200 μm的细胞比例分别占总细胞数量的14.9%和18.0%.上述结果说明，东莨菪内酯可剂量依赖性地抑制HFD-诱导的肥胖小鼠的脂肪在肩胛骨组织和附睾丸组织中的积蓄.

图2 东莨菪内酯对小鼠脂肪组织的病理形态学影响(放大倍数×200)

3.3 东莨菪内酯对小鼠附睾丸脂肪组织的基因表达影响

固醇调节元件结合蛋白-1α(SREBP-1α)是一类位于内质网上的膜连接蛋白，是参与脂肪合成的主要转录调节因子，并可以对参与脂肪酸合成的下游靶基因FAS和SCD1进行调控[17].过氧化物酶体增殖活化体受体-γ(PPAR-γ)是脂肪细胞分化的关键调控因子，它不仅使脂肪细胞数量增加，还能够促进脂肪细胞TG的合成；aP2为PPAR-γ的下游,它与脂类储存及脂类代谢的靶基因调节相关[18].脂肪组织中的SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ、aP2基因表达增多说明脂肪的合成能力增强.由图3可以看出，与CON组的小鼠相比，HF组小鼠的白色附睾丸脂肪组织中的SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ及aP2基因表达增多，而东莨菪内酯给药组的上述基因表达明显呈剂量依赖性地减少，即东莨菪内酯能够通过下调SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ、aP2基因的表达来减少脂肪在小鼠附睾丸组织中的积蓄.

图3 东莨菪内酯对小鼠附睾丸脂肪组织基因表达的影响

4 结论

本文实验结果表明，东莨菪内酯对HFD-诱导的肥胖小鼠的血脂及其脂肪积蓄具有良好的改善作用，同时可显著减小小鼠附睾丸脂肪组织的细胞大小.此外，东莨菪内酯还能够下调小鼠附睾丸脂肪组织中与脂肪合成有关基因(SREBP-1α、FAS、SCD1、PPAR-γ、aP2)的表达.本文结果可为东莨菪内酯在预防或治疗肥胖方面的药物开发提供理论基础.