固相萃取-超高效液相色谱法同时测定猪肉中22 种磺胺类药物残留

2021-07-28王宏宇武云龙赵栋皓孙晓亮李木子曹旭敏宋翠平赵思俊

中国动物检疫 2021年7期

王宏宇，武云龙，赵栋皓，孙晓亮，李木子，曹旭敏，宋翠平，赵思俊，李存

（1.天津农学院动物科学与动物医学院，天津 300384；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山西农业大学动物医学院，山西晋中 030801）

磺胺类药物（sulfonamides，SAs）是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的药物总称，具有抗菌谱广、高效、低毒、价格低廉等特点，在兽医临床应用十分广泛。药物滥用、误用及不遵守休药期规定，会造成动物源食品中药物残留超标，既危害人类健康，还会诱导细菌产生耐药性。我国和欧盟均已制订了动物产品中的多种SAs 最高残留限量（MRL），其中我国规定SAs 总量不得超过0.1 mg/kg，奶中磺胺二甲基嘧啶不得超过0.025 mg/kg[1]。因此，对SAs 残留进行准确快速检测有着重要的食品安全意义[2]。

随着药物残留检测技术的不断发展，SAs 的前处理和检测方法越来越多。其中：前处理方法除了传统的液液萃取外，近年来还出现了许多新方法，如固相萃取（SPE）法、超声辅助分散液液微萃取法、磁性多壁碳纳米管法、基质固相分散法、QuEChERS 法等[3]；检测方法主要有高效液相色谱二极管阵列检测法（HPLC-PDA）、液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）、酶联免疫法等[2，4]。目前，我国已建立了多个检测标准用于猪肉中SAs 残留检测。《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB/T 20759—2006）中标定了牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和兔肉中16 种SAs 残留量的液相色谱-串联质谱测定方法，《水产品中17 种磺胺类及15 种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（农业部1077 号公告-1-2008）规定了17 种SAs 残留量的液相色谱-串联质谱法。但这些方法一次检测的药物种类较少，成本相对较高，且基质效应的存在会影响检测结果的准确度和灵敏度[5]。本研究拟采用固相萃取-超高效液相色谱法（SPE-UPLC-PDA），建立猪肉中22 种SAs 的一次性残留检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备 AcquityTMUPLC-PDA 超高效液相色谱仪-二极管阵列检测器，美国Waters公司；氮吹仪，美国Organomation 公司；漩涡混合仪，美国Talboys 公司；Milli-Q 纯水仪，德国Millipore 公司；5804R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；固相萃取装置、MCX 固相萃取柱（60 mg、3 mL），德国CNW 公司。

1.1.2 主要药品试剂磺胺甲恶唑（sulfamethoxazole，纯度＞94%）、磺胺胍（sulfaguanidine，纯度＞98%）、磺胺醋酰（sulfacetamide，纯度＞97%）、磺胺吡啶（sulfapyridine，纯度＞98%）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，纯度＞99%）、磺胺二甲异嘧啶（sulfisomidine，纯度＞98%）、磺胺二甲恶唑（sulfamoxole，纯度＞98.5%）、磺胺二甲异恶唑（sulfisoxazole，纯度＞98%）、磺胺曲沙唑（sulfatroxazole，纯度＞99%）、磺胺对甲氧嘧啶（sulfameter，纯度＞95%）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，纯度＞96%）、磺胺甲氧吡嗪（sulfalen，纯度＞97%）磺胺间二甲氧嘧啶（sulfamethazine，纯度＞99%）、磺胺苯（sulfabenz，纯度＞96%）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazole，纯度＞98%）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，纯度＞97%），均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。磺胺（sulfonamide，纯度＞99%）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，纯度＞99%）、磺胺邻二甲氧嘧啶（sulfadoxine，纯度＞98%）、磺胺氯哒嗪（sulfachloropyridazine，纯度＞97%），均购自Toronto Research Chemicals INC（加拿大）。磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，纯度＞98%）、磺胺噻唑（sulfathiazole，纯度＞99%）、磺胺氯吡嗪（sulfachloropyrazine，纯度＞98%），均购自WITEGA Laboratorien BerlinAdlershof GmbH（加拿大）。甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Merck 公司；甲酸、甲酸铵均为色谱纯，德国CNW 公司；乙酸、氨水均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试验用水为超纯水，由Milli-Q 纯水仪制得。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配置分别准确称取22 种SAs标准品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制质量浓度为100 mg/L 的标准储备液，于-20 ℃避光保存；分别移取适量标准储备液，配制1 mg/L 的22 种SAs 混合标准储备液；分别移取适量的混合标准储备液，根据需要用甲醇逐级稀释为适当浓度的混合标准工作液，现用现配。

1.2.2 样品前处理准确量取2 g 猪肉于50 mL具塞离心管中，加入8 mL 3%乙酸乙腈以及5 g 均质子，涡旋混匀，8 000 r/min 离心7 min，将上清移至新离心管，重复提取1 次，合并2 次上清，待净化。上清液通过经3 mL 甲醇、3 mL 水以及3 mL 3%乙酸乙腈活化的MCX 柱，分别用3 mL 水和3 mL 甲醇淋洗，用真空泵抽干后，以3 mL 5%氨化甲醇洗脱，45 ℃水浴条件下N2吹至近干，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液复溶，涡动30 s 后，经0.22 μm 针孔式滤膜过滤，UPLCPDA 检测。

1.2.3 色谱条件色谱柱：UPLC CSH Fluorophenyl（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A（简称A）：含有10 mmol/L 甲酸铵的0.1%甲酸水；流动相B（简称B）：乙腈。流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，二极管阵列检测器波长270 nm，进样量10 μL。梯度洗脱程序：0～2.0 min，13%B；＞2.0～3.5 min，13%～15%B；＞3.5～4.5 min，15%B；＞4.5～6.5 min，15%～35%B；＞6.5～8.8 min，35%B；＞8.8～9.0 min，35%～95%B；＞9.0～10.0 min，95%B；＞10.0～10.2 min，95%～13%B；＞10.2～12.0 min，13%B。

1.3 方法评价

1.3.1 试剂标准曲线绘制配制质量浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的试剂标准溶液。经UPLC-PDA 进样分析，以质量浓度（μg/L）为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标，绘制试剂标准曲线。

1.3.2 检测限和定量限测定准确量取2 g 空白样品，向其中添加不同质量浓度的混合标准工作液，按照1.2.2前处理方法对样品进行处理后上机检测。以10 倍信噪比（S/N=10）对应的样品浓度作为方法的定量限（limit of quantification，LOQ），以3倍信噪比（S/N=3）对应的样品浓度作为方法的检测限（limit of detection，LOD）。

1.3.3 添加回收率和精密度测定准确量取2 g空白样品，进行3 个水平（1、5、10 倍LOQ）的加标回收试验；按照1.2.2 前处理方法对样品进行处理后上机检测。每个水平做6 个平行，进行3 次批间重复；使用标准曲线进行校正，测定目标药物浓度，计算回收率、批内相对标准偏差和批间相对标准偏差。

1.3.4 实际样品检测采用本试验建立的方法，对从山东省采集的18 份猪肉样品进行检测。18份样本经过3%乙酸乙腈提取、MCX 柱净化、UPLC-PDA 检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

由于同分异构体药物分离受限，故在流动相中加入一定量甲酸铵，使其能全部分离所有药物[6]。

磺胺类药物属于两性化合物，因此采用酸性流动相可使分离效果最佳。试验采用甲酸铵-甲酸水溶液-乙腈体系作为流动相，用0.1%甲酸-乙腈作为流动相。虽色谱峰尖锐、对称，但不能分离所有药物，故在甲酸溶液中加入适量甲酸铵进行考察。结果显示，使用含有10 mmol/L 甲酸铵的0.1%甲酸水-乙腈作为流动相，能分离出所有药物且峰形较好。为了将本试验中的药物在尽可能短的时间内有效分离，本研究采用UPLC CSH Fluoro-phenyl 色谱柱分离所有药物，采用PDA 波长270 nm，可使SAs 检测获得较高的灵敏度[7]。SAs 标准溶液色谱图、空白样品色谱图和实际样品加标色谱图分别见图1-A、图1-B、图1-C。

图1 标准溶液、空白样品和实际样品加标色谱图

2.2 提取液优化

提取动物产品中的SAs 通常采用乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂或磷酸盐水溶液进行[8-9]。为了获得满意的回收率和较好的选择性，本试验选择有机溶剂和水溶液作为提取液进行优化比较。

2.2.1 有机溶剂样品基质中的蛋白质等大分子杂质会因共萃取效应而被提取出来。由于蛋白质的最佳吸收波长为280 nm，与SAs 的检测波长较为相近，因此在紫外检测时容易影响SAs 检测的灵敏度和选择性。相关研究表明：乙腈可以沉淀牛奶等样品中的蛋白质，使蛋白质达到等电点沉淀[10]；而采用乙酸乙酯和甲醇进行提取，对组织样本中目标化合物回收具有良好效果[11]。为此，本研究分别采用乙酸乙酯、甲醇和乙腈提取样品，经MCX柱净化后，使用UPLC 检测，统计目标药物回收率。结果显示：乙酸乙酯和甲醇不能完全从样品中提取药物，受基质中的内源物质干扰较大，分离不佳，且由于溶剂性质原因[12]，大量脂溶性杂质溶于提取液中；而使用乙腈作为提取液时，除磺胺、磺胺醋酰外，回收率均高于80%。此外，还对乙腈的酸度进行优化分析，通过向提取液中加入乙酸或氨水等调节溶液pH。以乙腈、氨化（1%、3%、5%）乙腈、乙酸（1%、3%、5%）乙腈分别提取样本，比较不同提取液的提取效果。结果显示：使用3%乙酸乙腈，可有效提取猪肉组织中的SAs，可获得较好的回收率；增加乙酸使用量（5%），虽不影响药物回收率，但会增加萃取中杂质的干扰；而减少乙酸使用量（0、1%）时，可使SAs 回收率降低（＜80%）。

2.2.2 水溶液本试验对PBS 溶液的提取效果进行了优化，分别对PBS 溶液的pH、浓度进行优化分析。首先优化PBS 提取液pH，分别使用pH3～6的PBS 溶液进行提取。结果显示：使用PBS 溶液（pH5）时，可提取猪肉组织中的SAs，并获得了较好的回收率。增加溶液pH（pH6）时，磺胺醋酰、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲恶唑回收率降低（＜80%）；而降低溶液pH（pH3、pH4），虽不影响药物回收率，但会增加萃取中杂质的干扰，故选择pH5 的PBS 溶液。此外，还对PBS 溶液浓度进行优化分析，分别使用0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mol/L 的PBS 溶液（pH5）提取样本。结果显示：使用0.5 mol/L PBS（pH5）溶液，可提取猪肉组织中的SAs，并获得了较好回收率；当PBS 溶液浓度过低时，磺胺、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺苯、磺胺对甲氧嘧啶的回收率小于80%；而提高PBS 溶液浓度，对目标药物回收率没有明显影响。故选择0.5 mol/L PBS（pH5）溶液作为最佳水溶液提取液。

2.2.3 两种提取液对比对最优的有机溶剂提取液（3%乙酸乙腈）以及水溶液提取液（0.5 mol/L PBS，pH5）进行比较。分别使用两种提取液提取样本，经MCX 柱净化后，使用UPLC-PDA 检测。结果显示：以PBS 溶液、酸化乙腈作为提取液时，目标药物回收率均较高。但在试验过程中发现，以PBS 溶液作为提取液，在提取完成的待上样液中，含有大量白色絮状物，会堵塞SPE 柱，从而引起流速不稳甚至出现流不动的现象，导致试验结果平行性较差[13]。因此，本研究选择3%乙酸乙腈作为猪肉样品提取液。

2.3 净化条件优化

2.3.1 SPE 固相萃取柱选择本研究选取1#（CNW-HLB 柱）、2#（Oasis HLB 柱）、3#（CNW-MCX 柱）、4#（PCX 柱）进行比较。标准添加量为50 μg/kg，经甲醇、水和上样液活化的SPE 柱富集，用甲醇或5%氨化甲醇洗脱，比较各SPE 柱对目标药物的富集效果。结果显示，1～4#的富集比例分别为90%、85%、90%和83%。结果表明，4 种SPE 柱均可富集SAs，且CNW 公司生产的HLB 柱（1#）以及MCX 柱（3#），对目标药物的富集效果较好。考虑到在试验过程中，由于提取液为乙腈，只有在过HLB 柱前氮吹至近干，再使用复溶液复溶后，才可继续进行净化步骤，因而容易导致目标药物损失[14]，且会浪费大量时间；而MCX 柱，由于其为阳离子交换柱，对pH 较为敏感，以3%乙酸乙腈作为提取液时，可以直接上样。故选择3#作为SPE 固相萃取柱。

2.3.2 洗脱液优化按参考文献[15-16]，选择4种洗脱液，1%氨化甲醇、3%氨化甲醇、5%氨化甲醇、7%氨化甲醇，各取3 mL 洗脱液过已富集的MCX 固相萃取柱，比较洗脱效果。结果显示：5%和7%的氨化甲醇洗脱能力无明显差异（＞95%），可完全将药物从柱床中洗脱下来，1%氨化甲醇仅可洗脱下20%～40%，而3%氨化甲醇可洗脱下60%～80%，故选择5%氨化甲醇作为洗脱溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围、相关系数、检出限和定量限以不同浓度的混合标准溶液进行测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制试剂标准曲线。结果（表1）显示：各药物线性关系良好，相关系数R2＞0.999。LOQ 为2.5～10.0 μg/kg，LOD为1.0～4.0 μg/kg。

表1 22 种兽药的保留时间、线性方程、相关系数和LOQ、LOD

2.4.2 准确度和精密度 22 种目标药物回收率及批内、批间相对标准偏差见表2。结果显示，回收率为80.4%～96.6%，批内相对标准偏差为1.1%～4.6%，批间相对标准偏差为2.5%～13.4%，可满足国际上对兽药残留的检测需求。

表2 22 种兽药的加标回收率和相对标准偏差

2.5 相对于UPLC-MS/MS 的优势

在使用UPLC-MS/MS 法时，基质效应（matrix effects，ME）的存在会影响检测结果的准确度和灵敏度[17]。经前处理样品中加入目标药物，进行UPLC-MS/MS 检测，绘制基质匹配标准曲线，通过计算各药物样本溶液与浓度相同的标准溶液之比的平均值，计算目标药物的基质效应[18]。结果显示：目标药物中有部分基质效应较强（ME ＜60%），包括磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶；部分基质效应很强（ME ＜40%），包括磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯。基质效应严重影响结果的准确度和灵敏度，且UPLC-MS/MS 成本较高，操作复杂。而本研究的UPLC-PDA 法不存在基质效应影响，在经前处理后杂质较少，且成本较低、操作简便，结果准确性较高，重复性良好。