基于网络药理学结合分子对接探讨中药枸骨叶抗肿瘤的作用机制

龙书可　方玲子　林菲娟　邓燕桃　姜倩倩

〔摘要〕 目的 從网络视角出发，探讨枸骨叶抗肿瘤的的可能作用机制，为其临床使用提供依据。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中医百科全书数据库（ETCM）及查阅相关文献，获取枸骨叶的有效成分及潜在靶点。利用人类基因组注释数据库（GeneCards）结果对比，获得枸骨叶与肿瘤重合的潜在靶点基因，并通过Cytoscape 3.6.0软件构建枸骨叶的“候选成分-作用靶点”网络。利用String数据库和Cytoscape 3.6.0软件构建药物抗肿瘤的蛋白质相互作用（PPI）网络;并通过分子对接验证和筛选潜在的核心化合物，利用DAVID生物信息资源数据库对核心靶点进行基因本体论（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果 共筛选出枸骨叶抗肿瘤的作用的靶点137个，对应13种有效成分。关键靶点涉及TP53、MAPK1、STAT3等。主要通过调控肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/AKT）信号通路、肿瘤抑制因子P53信号通路、T细胞受体信号通路等发挥抗癌作用。涉及的癌种包括前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等。分子对接结果显示，长梗冬青苷与MAPK1能稳定地结合并通过蛋白氨基酸Gly32、Glu33、Gly34、Tyr36等发生相互作用。结论 枸骨叶抗肿瘤作用的主要机制涉及槲皮素、熊果酸、长梗冬青苷、芒柄花黄素为代表的多成分，以TP53、MAPK1及STAT3为代表的多靶点，以及细胞增殖、细胞凋亡、信号传导为代表的多通路。

〔关键词〕 枸骨叶;抗肿瘤;网络药理学;分子对接

〔中图分类号〕R273       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.021

〔Abstract〕 Objective To explore the anti-cancer potential of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） from a network perspective， so as to provide a theoretical basis for its clinical use. Methods The effective components and potential targets of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） were obtained through the traditional Chinese medicine （TCM） systems pharmacology database （TCMSP）， the encyclopedia of TCM （ETCM） and refer to relevant literatures. By comparing the results of human genome database （GeneCards）， the overlapping genes of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） and cancer were collected. The "candidate active components-targets" network of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） was built with Cytoscape 3.6.0 software. The anti-tumor protein interaction （PPI） network was constructed using the STRING database and Cytoscape 3.6.0 software. Through molecular docking verification and screening of potential core compounds. The gene ontology （GO） classification enrichment analysis and the kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis for the targets were carried out in DAVID database. Results Total 137 anti-tumor targets of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） were screened out， corresponding to 13 active components. Key targets involved TP53， MAPK1， STAT3， etc. It mainly plays an anti-cancer role by regulating tumor necrosis factor （TNF） signaling pathway， hypoxia induced-factor-1 （HIF-1） signaling pathway， phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K/AKT） signaling pathway， tumor suppressor factor P53 signaling pathway， T cell receptor signaling pathway， etc. The cancers involved prostate cancer， pancreatic cancer， non-small cell lung cancer， etc. Molecular docking results showed that pedunculoside and MAPK1 could bind stably and interact with each other through protein amino acids such as Gly32， Glu33， Gly34 and Tyr36. Conclusion The main mechanism of Gouguye （Ilicis Cornutae Folium） in treating cancer is involved to multiple compounds represented by quercetin， ursolic acid， pedunculoside and formononetin， and multiple targets represented by TP53， MAPK1 and STAT3， and multiple signaling pathways represented by cell proliferation， apoptosis and signal transduction.

〔Keywords〕 Gouguye （Ilicis Cornutae Folium）; anti-cancer; network pharmacology; molecular docking

近年来，肿瘤患者的新发病例越来越多，严重威胁人类的身体健康，我国癌症统计数据显示，全国癌症新发病例数为380.4万例，死亡病例229.6万例[1]。随着化疗、靶向治疗及免疫治疗的应用，越来越多肿瘤患者从中获益，而中医药治疗作为我国肿瘤治疗的重要组成部分，采取辨病与辨证相结合的办法，可以配合肿瘤放化疗等治疗手段，有效减轻毒副作用，抑制瘤体的增大，减少不良反应的发生，利于改善患者对肿瘤治疗的耐受能力[2]。

枸骨叶为冬青科植物枸骨Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.的干燥叶，具有清热养阴、平肝益肾作用，用于肺痨咯血、骨蒸潮热、头晕目眩等症状[3]。现代研究[4-8]表明，枸骨叶具有降脂、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用，其中主要化学成分长梗冬青苷、熊果酸、槲皮素等对多种恶性肿瘤均有较好的治疗作用。临床运用中，含枸骨叶的方剂“扶肺煎”治疗肺癌的药理作用已有相关报道[9]，但枸骨叶基础研究较少，其抗肿瘤的药用有效成分、靶点、通路和相关分子作用机制未见报道。网络药理学是结合系统生物学、计算机技术及生物信息学的新兴学科，能整体系统地分析“药物-靶点-通路-疾病”之间的相互关系，为中医药的现代化研究提供了新的研究思路。本研究利用网络药理学方法探索枸骨叶的主要化学成分、核心靶点以及与肿瘤之间的相互关系，为进一步阐明枸骨叶抗肿瘤的作用机制提供思路和理论基础[10-11]。

1 材料与方法

1.1  数据库、分析平台及软件来源

中药系统药理学分析平台（TCMSP， https：//tcmspw.com/tcmsp.php）;中医百科全书数据库（ETCM，

http：//www.tcmip.cn/ETCM/）;有机小分子生物活性数据库（PubChem， https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;Swiss TargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）;人类基因数据库（GeneCards， https：//www.

genecards.org/）;DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）;DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）;RCSB蛋白数据库（https：//www.rcsb.org/）;STRING数据库（https：//string-db.org/）;Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/）;在线云平台OmicShare网站（https：//www.omicshare.com/）;网络拓扑属性分析软件Cytoscape 3.6.0;分子对接软件Autodock vina 1.1.2;PyMOL 2.3.2（https：//pymol.org/2/）;LigPlot 2.2（https：//www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/）。

1.2  研究方法

1.2.1  枸骨叶活性成分检索与靶点预测  借助TCMSP数据库，以“枸骨叶”为关键词搜索活性成分，根据药物ADME（吸收、分布、代谢及排泄）特性，选取生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件，并根据文献检索增加枸骨叶中有明确药理活性的主要成分，将检索所得各个主要成分于TCMSP数据库、ETCM数据库中检索相关靶点，对于未找到靶点的化合物从PubChem数据库中查找并下载2D结构，导入Swiss Target Prediction在线数据库中进行靶点预测，Swiss Target Prediction在线数据库广泛应用于中药作用机理和潜在治疗靶点的研究[12]。剔除预测概率为“0”的靶点。将靶点名称输入到STRING数据库中统一为规范基因名。

1.2.2  疾病及相关基因信息数据库建立  从GeneCard数据库中以“cancer”为关键词搜集肿瘤的疾病作用靶点，在DisGeNET数据库中以“Malignant Neoplasms”为关键词搜索，得到的靶点合并去重后，将其导入EXCEL表格中进行标准化处理以便后续的统计分析。

1.2.3  蛋白互作PPI网络模块分析与关键靶点筛选  将枸骨叶化合物预测得到的靶点与肿瘤疾病靶点求交集，将共有靶点导入STRING数据库获取蛋白质相互作用（protein-protein interaction， PPI）网络，导入Cytoscape 3.6.0软件进行可视化分析，确认了PPI网络中的关键靶基因并进行分析。

1.2.4  分子对接  选择PPI网络中度值靠前的靶点蛋白，從RCSB蛋白数据库下载蛋白三维结构，从PubChem数据库下载化合物结构，将准备好的蛋白文件、配体文件、化合物文件以及脚本放入相应文件夹，利用Autodock vina 1.1.2进行半柔性对接。选取对接结合能量最低的构象用于对接结合模式分析，并使用PyMOL2.3.2和LigPlot 2.2进行作图。

1.2.5  GO功能富集和KEGG通路富集  将枸骨叶与肿瘤疾病的共有靶点映射到STRING数据库，进行GO功能富集和KEGG通路富集，从生物过程及信号通路角度分析枸骨叶治疗肿瘤可能的作用机制。

2 结果

2.1  枸骨叶活性成分与候选靶点

通过TCMSP数据库检索的枸骨叶化学成分56个，以OB≥30%，DL≥0.18的原则，筛选出枸骨叶活性化合物10个，结合文献查阅结果[13-15]，增加4个虽然OB、DL值较低，但含量較高并且有药理活性的成分：齐墩果酸、羽扇豆醇、金丝桃苷、熊果酸纳入研究。最终得到14个活性成分。见表1。

2.2  枸骨叶抗肿瘤作用靶点及主要成分预测

通过TCMSP数据平台、PubChem数据库查找相关的化合物并进行靶点预测，对相同靶点去重筛除，最终得到枸骨叶潜在的靶点信息259个。

2.3  肿瘤相关靶点基因的获取

从GeneCard数据库中以“cancer”为关键词搜集肿瘤的疾病作用靶点，以score≥20作为疾病靶点筛选的标准，得到780个靶点，在DisGeNET数据库中以“malignant neoplasms”为关键词搜索，以EI≥1，score≥0.1作为筛选标准得到955个靶点，将搜集到的靶点合并去重后，共获得肿瘤靶点基因1 529个。将枸骨叶的靶基因与肿瘤相关基因进行映射，得到共同靶基因137个。

2.4  成分-靶点网络构建

在Cytoscape 3.6.0软件中导入共同靶基因，剔除非作用于肿瘤疾病相关靶点的化合物构建成分-靶点网络。此网络共包括节点150个，其中13个节点为活性成分（并非所有活性成分均可作用于肿瘤相关靶点，剔除1个未作用于任何靶点的活性成分），共有137个节点为作用靶点，270条作用连线。可见枸骨叶抗肿瘤具有多成分、多靶点的特点。见图1。

2.5  核心靶点PPI网络的构建

将枸骨叶与肿瘤的靶基因导入STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”进行操作，最低相互作用阀值设为高等“high confidence=0.7”，构建PPI网络，并利用Cytoscape 3.6.0软件对PPI网络进行拓扑结构分析，最终116个基因参与了关联网络的构建，包含了993个作用连线。见图2。借助软件中Network analyzer插件，分析网络图的拓扑学参数，圆形节点的大小由其度值大小决定，度值越大，节点越大。网络拓扑学结构分析显示，全网平均度值为17.12，筛选度值≥30的核心靶点包括：TP53、MAPK1、STAT3、IL6、MAPK8、VEGFA、MYC、MAPK3、CCND1、EGF、EGFR、P90AA1、ESR1、CASP3、CXCL8、STAT1、RELA、FOS、PTGS2，提示枸骨叶抗肿瘤作用可能与这些靶点显著相关。将这19个核心靶点导入Metascape数据库，获得靶点对应的蛋白功能。见表2。表明枸骨叶抗肿瘤作用中有转录因子、酶和信号通路等相关蛋白物质和信号通路的参与。

2.6  分子对接结果及分析

利用AutoDock vina 1.1.2软件，对PPI网络中度值较大的3个靶蛋白（TP53、MAPK1、STAT3）与枸骨叶中预测靶点较多的5个成分进行分子对接。对接结果显示（表3），分子与标靶蛋白的最低结合能均小于0，说明配体与受体均可以自发结合，其中长梗冬青苷与P53、STAT3、MAPK1蛋白的对接结合能均小于-5 kcal·mol-1，结合能分别为-6.8、-6.7、-8.6 kcal·mol-1。将长梗冬青苷与MAPK1的对接结果利用Pymol软件绘图，由图可见，化合物的活性口袋中呈现出紧凑的结合模式。化合物和蛋白氨基酸Gly32、Glu33、Gly34、Tyr36、Gly37、Lys54、Val39、Ser153、

Leu156形成强烈的疏水性相互作用;与氨基酸Tyr113形成键长为3.12?的氢键作用;与氨基酸Asp111形成键长为3.28?的氢键作用;与氨基酸Asp167形成键长为2.99?和2.89?的氢键作用，这些相互作用使得蛋白与化合物形成稳定的复合物。见图3。

2.7  潜在靶点生物学功能分析

为了阐明枸骨叶抗肿瘤作用的分子机制，利用DAVID数据库对其活性成分对应的潜在靶点进行了GO和KEGG分析，GO功能注释是通过生物过程、分子功能和细胞组分对基因进行注释和分类。设定统计标准P<0.05，共富集到638条生物过程，对P值作检验校正，选取生物过程、分子功能及细胞组分排名前15的基因分别做条形图，由图4可知，生物过程排名靠前的有DNA转录调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控等;分子功能主要富集在酶结合区、蛋白结合、蛋白激酶结合、转录因子结合，主要涉及蛋白和转录因子活性;细胞组分分析中靠前的是胞液、胞外间隙、核质、细胞核等，主要集中在胞液和细胞核上，反映了肿瘤发病涉及体内多个生物过程的异常，同时表明枸骨叶可能是通过调节这些生物过程发挥其抗肿瘤作用。

KEGG通路分析得到枸骨叶抗肿瘤相关通路，分析排名前30条信号通路并作气泡图，得知枸骨叶主要富集在TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K/AKT信号通路、p53信号通路、T细胞受体信号通路等。这些生物过程与肿瘤的发生发展密切相关。见图5。

3 讨论

3.1  肿瘤发生、发展的分子机制研究

遗传和表观遗传的改变使得细胞逃避控制其存活和迁移的机制不断增殖，导致癌症的产生[16]。Hanahan等[17]根据现代肿瘤发生发展机制，提出了肿瘤（hallmarks）学说，包括维持增殖信号、逃避生长抑制、避免免疫破坏、增强无限复制、癌性促炎反应、激活侵袭转移、诱导血管生成、基因组不稳定与突变、细胞死亡抵抗、细胞能量代谢失衡等。其中MAPK、PI3K/Akt、mTOR、EGFR等促进细胞周期，推动细胞增殖，TP53、NF2、LKB1上皮极性蛋白可以逃逸抑癌蛋白RB的生长抑制，此外，癌细胞还通过突变、促炎反应、诱导血管生成等制造免疫抑制肿瘤微环境进行增殖、向周边浸润、转移逃避免疫破坏。

3.2  枸骨叶抗肿瘤的主要活性成分与关键靶点探讨

本研究得到的枸骨叶治疗肿瘤的的成分靶点网络图显示槲皮素、山奈酚、异鼠李素、芒柄花黄素、长梗冬青苷等14種化合物的连接度与介度较高，可作用于多个肿瘤靶点，提示这些成分可能是枸骨叶治疗肿瘤的重要成分。王梓萱等[18]研究槲皮素能通过诱导P53非依赖性的G2/M细胞周期阻滞和细胞凋亡，从而实现对肿瘤细胞增殖的抑制作用。现代研究[19]表明，槲皮素可以调节与癌症相关的多种miRNAs，包括let-7、miR-21、miR-146a和miR-155，从而抑制癌症的发生和发展。张磊等[20]发现山奈酚能诱导三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）MDA-MB-231细胞中乳腺癌耐药蛋白的表达并下调抗肿瘤药物对MDA-MB-231细胞的杀伤作用，还有研究[21-22]表明山奈酚可诱导G1期以下细胞聚集，并通过抑制内质网受体、Survivin凋亡抑制基因和ERα从而导致细胞凋亡。朱琳等[23]体外实验研究发现异鼠李素处理A549细胞后，流式细胞术及免疫细胞化学检测表明异鼠李素通过下调bcl-2基因和PCNA蛋白表达，上调抑癌基因P53、bax及Caspase-3基因等来抑制肿瘤细胞的生长、增殖及诱导细胞凋亡。在体动物实验也观察到，异鼠李素在体内也具有明显的抗肿瘤作用，可显著降低癌细胞增殖指数，诱导凋亡。李自全等[24]研究发现芒柄花黄素可抑制NSCLC细胞增殖，加速细胞凋亡发生，可能通过下调Cyclin E1表达而影响细胞周期，并通过调控Bcl-2和Bax表达促使细胞凋亡发生。陈曦等[25]发现长梗冬青苷可以抑制炎症相关癌症（colitis associated cancer， CAC）小鼠结肠miR-29a表达，上调miR-29a下游靶蛋白TET3的表达，同时抑制STAT3蛋白表达，可能是其干预CAC小鼠模型中结肠炎——癌病理发展的部分机制。还有研究[26]表明长梗冬青苷可通过逆转由miR-31-5p和miR-223-3p过表达而引起的Lats2和Apc的下调，显著减轻DSS/AOM对小鼠肠道的损伤，从而预防CAC。

PPI网络分析结果发现，TP53、MAPK1、STAT3、IL6、MAPK8、VEGFA、MYC、MAPK3、CCND1、EGF、EGFR等19个靶点是PPI网络的关键靶蛋白。主要涉及TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K/AKT信号通路、p53信号通路、T细胞受体信号通路等，结合KEGG通路分析结果得出，主要富集的癌种为前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、慢性骨髓白血病、神经胶质瘤等。TP53是位于染色体17的短臂上的肿瘤抑制基因，通常调节细胞周期机制的活性。已观察到P53基因的突变在多种类型的人类癌症中具有高流行性，并且经常伴随点突变发生[27]。Zawlik等[28]研究表明胶质母细胞瘤经常显示TP53通路的基因改变，在胶质母细胞瘤中，MDM2 SNP309 G等位基因和TP53密码子72 Pro/Pro之间存在显著相关性。MAPK1、MAPK8、MAPK3是MAP激酶家族的成员，又称为细胞外信号调节激酶，是多种生物化学信号的整合点，参与细胞增殖、分化、转录调控和发育等多种过程[29]。Chen等[30]研究证明MAPK1是miR-378的直接靶点，MAPK1的异位表达挽救了miR-378被抑制细胞的迁移和侵袭，从而显著降低了前列腺癌细胞生长。

本研究的分子对接结果提示，枸骨叶中的活性成分与TP53、MAPK1、STAT3有较好的亲和力，其化合物抗肿瘤的作用需要进一步的生物实验验证。

综上所述，基于对枸骨叶有效成分进行的靶点预测，并对潜在靶点进行了PPI研究，以及GO和KEGG富集分析，发现枸骨叶中对应核心靶点较多的成分有槲皮素、芒柄花黄素、长梗冬青苷、熊果酸等，这些成分可能是枸骨叶发挥抗肿瘤的潜在活性成分。我们推测，枸骨叶抗肿瘤作用是多化合物、多靶点、多途径的直接或间接协同作用的结果。本研究为将来的实验设计及进一步探索提供了依据，后续将通过药理学实验验证枸骨叶的抗肿瘤药理活性作用，并进行枸骨叶中多种化合物的协同作用等方面的相关研究。

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