布地奈德及槐杞黄对卵清蛋白致敏哮喘型大鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

黄琳惠 丁秀秀 黄奕江 蔡兴俊

(海南省人民医院呼吸与危重症医学科 海南医学院附属海南医院，海南 海口 570311)

Effect of budesonide and Huaiqihuang on phagocytosis of macrophages OVA-induced asthmatic rats

HUANG Lin-Hui, DING Xiu-Xiu, HUANG Yi-Jiang,etal.

Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Hainan Province Hospital, Haikou 570311, Hainan, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of budesonide and Huaiqihuang on phagocytosis of macrophages in OVA sensitive asthmatic rats.Methods60 male SD rats were selected and divided into budesonide group(n=12), control group (n=12), Huaiqihuang group (n=12), model group (n=12), and combination group (n=12) by the numerical expression method. The model of anaphylactic asthma was induced by OVA. After the last excitation, SD rats were executed, paraffin slices were taken from the upper lobe of the right lung, and HE staining was performed. The levels of immune function indexes such as phagocytosis of alveolar macrophages, immunoglobulin (Ig)E, interferon(IFN)-γ, interleukin(IL)-4 and IL-17 were compared.ResultsCompared with control group, the IFN-γ was significantly decreased and IL-4 and IL-17 were significantly increased in the model group (P=0.001). Compared with model group, the level of IFN-γ was increased in Huaiqihuang group (P=0.001). Compared with budesonide group and Huaiqihuang group, the level of IFN-γ was significantly increased and IL-17 was significantly decreased in the combination group (P=0.001). The phagocytosis of alveolar macrophages in model group was significantly lower than that of budesonide group and Huaiqihuang group(P=0.001). The phagocytosis of alveolar macrophages was significantly higher in combination group than that of Huaiqihuang group and budesonide group(P=0.001).There was positive relation between phagocytosis of macrophages and the IFN-α level of bronchoalveo lar lavage fluide(r=0.724,P=0.001).ConclusionsBudesonide and Huaiqihuang have positive effects on the phagocytosis of alveolar macrophages in rats, and could improve the status and immune function of asthmatic rats.

【Keywords】 Huaiqihuang; Budinide; Alveolar macrophages; Indicator of immune function

哮喘是临床上常见的支气管慢性炎症之一，其致病机制为支气管受外界抗原性刺激导致气道阻塞，引发慢性炎症〔1〕。哮喘患者的临床表现多数为可逆性气流受限。据相关文献报道，哮喘发病主要因Th细胞功能失衡引起。肺泡巨噬细胞是修复组织吞噬功能恢复的主要细胞。哮喘加重的主要因素为肺泡巨噬细胞吞噬功能受损〔2〕。布地奈德属于糖皮质激素的一种，可有效控制患者病情，但部分病例仍存在慢性进展和反复发作情况；槐杞黄主治益气养阴〔3〕。适用于气阴两虚引起的体质虚弱，可有效提升机体免疫力。目前，临床上对哮喘大鼠免疫机制的影响多数为单一槐杞黄或布地奈德实验，二者联合实验研究甚少〔4〕。本研究探讨布地奈德及槐杞黄对卵清蛋白(OVA)致敏哮喘型大鼠巨噬细胞吞噬功能的影响。

1 资料与方法

1.1实验动物 随机选取购自沈阳嘉乾程生物科技有限公司SPF级4～6周龄SD大鼠60只进行实验，运用随机数表法分为布地奈德组(n=12)、对照组(n=12)、槐杞黄组(n=12)、模型组(n=12)和联合组(n=12)。体重120～140 g。在50%湿度；23～25℃室温下饲养1 w。

1.2实验药品 布地奈德混悬液(国药准字：H20140475)规格：2 ml:1 mg×5支；AstraZeneca Pty Ltd公司生产。槐杞黄颗粒(国药准字：B20020074)规格：10 g×6袋/盒；启东盖天气药业公司生产。致敏混悬剂：OVA、氢氧化铝干粉各100 mg；5×109个灭火百日咳杆菌。

1.3哮喘模型建立 除对照组外4组大鼠进行建模，分别于实验第1天、第8天进行100 ml致敏混悬剂注射，实验第15天激发哮喘，每日上午8∶00,雾化吸入8 ml;1%OVA,1 d/次，连续7 d。以上4组均出现呼吸频率加快、运动迟缓等情况证明激发成功。

1.4给药方法 ①对照组、模型组：运用等剂量生理盐水进行雾化、注射。②槐杞黄组：实验第15天，激发前按照0.4 g/100 g剂量槐杞黄灌胃。③布地奈德组：实验第15天，激发前按照2 mg剂量布地奈德雾化。④联合组：实验第15天，激发前按照0.4 g/100 g剂量槐杞黄灌胃，2 mg剂量布地奈德雾化。

1.5实验标本制备 ①血浆标本留存：末次激发后24 h秤取大鼠重量，并标号，腹腔麻醉后处死。运用抗凝管进行血液收集〔5〕。转速为5 000 r/min,DD5自动脱帽离心机运行5 min，取样本血浆在冰箱，-70℃保存，选取其他实验室仪器进一步检查。②肺泡灌洗：基于Careau等〔6〕方法，利用无菌4℃磷酸盐缓冲液(PBS)对肺泡进行灌洗，进而获取上清液和细胞。本实验向肺泡中注入PBS 6 ml后，等待1 min进行回抽，回抽操作需重复3次，整个实验共灌洗16次，PBS总用量为92 ml。对实验中每次灌洗回抽的回收量进行详细的记录，并通过计算得出准确的回收率。实验结果表明，每次灌注的回收率都在80%之上。对前2次的灌洗液进行收集，收集量约为10 ml，并将经过离心操作后的上清放置于-70℃的环境下存储，以供后续的细胞因子检测使用，最后对灌洗液中剩余的细胞沉淀进行收集。③免疫指标：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血清白细胞介素(IL)-4、IL-17、干扰素(IFN)-γ表达水平〔7〕。实验仪器：芬兰MK3-酶标仪，达科生物技术有限公司生产试剂盒。 依据说明书操作步骤进行。④巨噬细胞吞噬功能：依据2007年梁伟烽等〔5〕研究方法进行中性红吞噬实验，将沉淀细胞进行24 h培养后，弃上清液,PBS洗3次。将未贴壁细胞吸出后取得单层巨噬细胞〔8〕。在5%CO2培养箱中放置200 ml 0.1%中性红溶液2 h，利用PBS对未被吞噬的中性红进行3次冲洗，加入细胞裂解液200 μl于每孔中，静置于4℃环境8 h以上(过夜最佳)，以空白孔调零，于490 nm处对吸光度OD值进行测定，仪器选用酶标仪。

1.6观察指标 ①各组免疫球蛋白(Ig)E、IFN-γ等免疫功能指标水平。②IL-4、IL-17等炎性因子表达水平。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组IgE与IFN-γ水平比较 各组IgE和IFN-γ水平比较：对照组>联合组>槐杞黄组>布地奈德组>模型组(均P<0.05)。见表1。

表1 各组Ig与IFN-γ水平比较

2.2各组炎性因子水平比较 模型组支气管肺泡灌洗液IL-4、IL-17表达水平明显高于其余各组，且对照组最低(均P<0.05)。见表2。

表2 各组炎性因子表达水平比较

2.3各组肺泡巨噬细胞吞噬功能比较 对照组中性红细胞吞噬实验结果(94.57±0.05)明显高于布地奈德组(80.57±0.02)、槐杞黄组(80.92±0.05)、联合组(89.38±0.07)、模型组(72.24±0.04，均P<0.05)。布地奈德组与槐杞黄组肺泡巨噬细胞吞噬功能显著优于模型组，而联合组肺泡巨噬细胞吞噬功能显著优于布地奈德组与槐杞黄组(均P=0.001)。

2.4免疫细胞因子和巨噬细胞吞噬功能相关性 巨噬细胞吞噬功能和支气管肺泡灌洗液中IFN-γ浓度呈正相关(r=0.724，P=0.001)。

2.5肺组织病理学改变比较 对照组：肺组织及支气管结构未见明显改变，各级支气管管腔细胞排列规则，细胞未出现脱落现象，炎性细胞浸润未在血管周围及支气管处出现，肺泡细胞上皮壁较薄，肺泡上皮细胞较为完整，肺泡腔无炎性细胞浸润，无渗出液出现。血管无扩张现象，水肿并未出现在血管周围。模型组：血管周边出现淋巴细胞浸润，支气管管腔内渗出黏液。上皮出现脱落、断裂。布地奈德组：对比模型组，支气管管腔内黏液渗出显著减少，且血管周边淋巴细胞浸润降低。槐杞黄组：对比模型组，支气管管腔狭窄程度有所改善减轻；但对比布地奈德组，血管周边淋巴细胞浸润改善情况较低。联合组：对比模型组，血管及支气管情况均明显改善。见图1。

图1 各组肺组织病理学改变(HE，×40)

3 讨 论

哮喘是IgE介导变态反应的一种，经典免疫学说提示，支气管哮喘主要病因是Th细胞功能免疫失衡〔9〕。哮喘患者体内会大量产生IgE和部分炎性细胞表面进行受体交联，导致机体内炎性因子大量释放引发气道高反应，导致哮喘发生。Th1、Th2 细胞会产生IFN-γ、IL-4等特征性细胞因子。IFN-γ对血液中IgE产生和气道黏膜中嗜酸性粒细胞聚集有一定程度抑制作用。

杨晋等〔10〕研究表明，INF-γ和IgE在哮喘的病情发展中有重要作用。布地奈德可通过调节IgE、IFN-γ表达水平，减轻大鼠炎症，改善其免疫功能。布地奈德可抑制内皮趋化因子、黏附因子表达和释放，直接对静脉上皮细胞产生作用，进而降低气道高反应性。

槐杞黄主要成分为槐耳菌质、枸杞子等。张琴珍等〔11〕指出，槐杞黄可有效提升IFN-γ表达水平。对增强Thl细胞功能有积极作用。本研究结果说明将槐杞黄用于布地奈德的辅助治疗，可有效降低哮喘大鼠模型肺组织IL-17表达，对Th1、Th2失衡效应予以有效纠正，联合用药效果显著优于单一糖皮质激素治疗。

文献报道〔12〕，大部分哮喘患者肺泡巨噬吞噬细胞功能存在不同程度障碍。而导致哮喘患者反复发作的主要因素为肺泡局部细胞功能下降。李红梅〔13〕研究表明单一糖皮质激素治疗对大鼠模型肺泡巨噬细胞吞噬功能无显著疗效。本研究结果表明槐杞黄可有效提升肺泡巨噬细胞功能。因槐杞黄可有效提升IFN-γ表达水平，而IFN-γ对巨噬细胞有活化功能，可显著提升其杀伤、吞噬功能〔14〕。

本研究结果推测，槐杞黄对提升巨噬细胞杀伤功能有积极意义，可能和提升IFN-γ表达水平有直接关联〔15〕。研究说明长期运用布地奈德会导致巨噬细胞杀伤能力和吞噬功能降低，导致其清除异物功能下降，免疫功能受限，机体抵抗力随之下降〔16〕。因此，临床长期单一运用布地奈德，病情会反复发作〔17〕。

综上，槐杞黄联合布地奈德可有效增强大鼠肺泡巨噬细胞杀伤能力和吞噬功能，降低其炎症状态，提升免疫功能。