Tricine-SDS-PAGE测定花椒籽蛋白 降血压肽的分子量分布

◎ 吴红洋

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121）

降血压肽（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides，简称ACEIP）是一类能够降低人体血压的小分子多肽，经研究证实对治疗高血压有很好的疗效，通过抑制肾素-血管紧张素系统（Renin-Angiotensin System，RAS）和激肽释放酶-激肽系统（Kallikrein-Kinin System，KKS）中的血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）活性而降低血压[1]。降血压肽来源广泛，从天然动、植物及微生物都可以提取出来，具有毒副作用低、降血压效果很明显等优点，目前人们已用酪蛋白[2]、大豆蛋白[3]、竹子[4]、藻类等制得了ACE抑制肽，因此，降血压肽已成为目前降血压药物研究的热点之一。

花椒籽蛋白降血压肽是花椒籽蛋白经特定蛋白酶酶解后制得的具有较高ACE抑制活性的产物，随着降血压肽研究的不断加深，小分子肽活性组分的分离、鉴别也逐渐受到重视[5]。目前测定小分子肽分子量的方法主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、高效液相色谱法、凝胶色谱法、质谱法等，其中SDSPAGE电泳法具有设备投入小、操作简单等优点，受到科研工作者的青睐。常规的Tris-Glycine-SDS-PAGE电泳只能分析分子质量在10～20 kDa的大分子物质，SCHAGGEER等[6]采用改进的三（羟甲基）甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）能够有效分离小分子蛋白、多肽。近年来的文献研究表明，此法对于不同酶解产物的小分子肽的分离条件和分离效果不尽一样。本文在前期研究基础上，将花椒籽蛋白降血压肽作为研究对象，优化Tricine-SDS-PAGE电泳条件，旨在找到一种简便可行、效果理想的适合花椒籽蛋白降血压肽分子量测定的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒籽蛋白，实验室自制。

SDS-PAGE蛋白质超低分子量多肽（3.3～20.1 kDa），购于上海源叶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力为2.0×105U·g-1），购于北京华迈科生物技术有限责任公司；Tricine、硼酸、四甲基乙二胺（TEMEND）、聚乙二醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、考马斯亮蓝R250、尿素、甘油、十二烷基磺酸钠（SDS）、β-巯基乙醇及过硫酸铵（AP）等均为分析纯；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等为电泳纯。

1.2 仪器与设备

Millipore Milli-Q型超纯水仪（美国Millipore）；HH-2数显恒温水浴锅（荣华仪器制造有限公司）；冷冻离心机（美国Thermo）；凝胶成像仪；垂直电泳仪（Bio-Rad）；CP225D型电子天平（德国Sartorius）；BP-20型pH计（德国Sartorius）；QL-901型涡旋仪（其林贝尔仪器制造公司）。

1.3 方法

1.3.1 花椒籽蛋白降血压肽的制备

参考相关文献[7-8]，得出花椒籽蛋白降血压肽的制备工艺：花椒籽蛋白→木瓜蛋白酶酶解→灭酶→冷却→离心→收集酶解液→超滤→凝胶层析→冷冻干燥→保存。

1.3.2 Tricine-SDS-PAGE电泳操作方法

（1）电泳缓冲液的配制。①阳极缓冲液：将24.228 g的Tris溶于800 mL的超纯水，用1.0 mol·L-1HCl调pH到8.9，再用超纯水定容到1 000 mL。②阴极缓冲液：将6.055 g的Tris、8.958 g的Tricine、0.5 g的SDS溶于超纯水，并定容到500 mL。③凝胶缓冲液：将36.3 g的Tris和0.3 g的SDS溶于80 mL的超纯水中，用1.0 mol·L-1HCl调pH到8.45，定容到100 mL。

（2）凝胶的制备。取3.0 mL分离胶液灌入模具内至一定高度，用水封顶，聚合完毕（约30 min左右），倾去水层，用滤纸吸净残留水。加入2.0 mL的间隙胶并进行水封，待间隙胶凝固后倾去水层，灌入1.5 mL浓缩胶溶液后立即插入干净的梳子，操作需快速，整个操作过程注意避免气泡的产生。凝胶的组成见表1。

表1 凝胶的组成表

（3）样品制备。样品缓冲液由4% SDS、12%甘油、50 mmol·L-1Tris、2% β-巯基乙醇（v/v）以及0.1%溴酚蓝组成，调pH=6.8，室温存放。取10 μL样品与等体积的样品缓冲液混合，沸水浴5 min后离心（10 000 r·min-1，10 min）。

（4）点样与电泳。将处理好的样品加入点样孔，每孔10 μL，同时点入超低分子量Marker作为参比。内槽加入阴极电泳缓冲液，外槽加入阳极电泳缓冲液，电泳开始时电压为30 V，待样品完全到达分离胶与间隙胶界面后，90 V恒压，当溴酚蓝指示剂距离分离胶底部1 cm处时，电泳结束。

（5）固定、染色、脱色。取出平板中的凝胶立即浸泡在固定液中固定1 h，再将固定后的凝胶置于45 ℃的考马斯亮蓝染色液中浸泡30～60 min，最后用洗脱液进行脱色，多次变换洗脱液直至电泳条带清晰、凝胶背景洗脱干净为止。

（6）成像。用凝胶成像系统成像，并观察电泳图谱。

2 结果与分析

2.1 凝胶种类对电泳效果的影响

目前，Tricine-SDS-PAGE电泳法有多种凝胶组合方式，有的是用分离胶、间隙胶和浓缩胶，有的仅用分离胶和浓缩胶。张锐昌等[9]采用三层梯度胶测定出小麦蛋白酶解物分子量的分布情况，而黄薇等[10]、孙波等[11]采用两层胶的电泳方法获得了理想的肽电泳显带结果。本文首先采用仅灌注浓缩胶和分离胶对花椒籽蛋白降血压肽进行电泳分离，电泳分离图谱如图1所示。

图1 电泳图谱图

由图1可知，Maker条带并未完全分离，随着分子量的降低，电泳条带堆积现象较严重，而样品除在20 100 Da附近有一个条带外，几乎看不见明显的条带，可能跟蛋白肽的种类和电泳缓冲液的浓度有关，因为适当的电泳缓冲液能保持蛋白质在电泳系统中的溶解性和稳定性[6]，因此后续将采用三层凝胶对花椒籽蛋白降血压肽进行分离测定。

2.2 不同分离胶浓度对电泳效果的影响

目前Tricine-SDS-PAGE电泳法测定分子量的方法关键在于凝胶的配制，其中不同分离胶的浓度对小分子肽的分离有较大影响。不同凝胶系统的电泳图谱见图2。

由图2可以看出，当分离胶浓度为20%时，随着分子量的降低，Maker条带弥散现象严重，并且有明显的拖尾现象，酶解液的条带在分子量为5 856 Da处呈堆积现象；当分离胶浓度为16.5%和15.5%时，Maker条带的电泳图谱背景浅，分辨率得到提高，拖尾现象也有一定改善，而酶解液在20 100 Da和5 856 Da处有条带，且浓度为15.5%时的电泳效果相对更好。

图2 不同凝胶系统的电泳图谱图

凝胶浓度大且孔径小时，电泳容易产生拖尾现象，样品分子不能正常进入凝胶中，导致分离效果不好，反之孔径大且凝胶浓度小会使来自样品中的各种蛋白质分子伴随着缓冲液向前流进，能使条带能很好的分离，从而降低了分辨率。研究表明，凝胶浓度提高到25%时，实验的电泳受阻，原因是分离胶孔径变小，因此凝胶浓度不是越高越好[12]。综上所述，实验选择分离胶浓度为15.5%。

2.3 分离胶中添加甘油对电泳效果的影响

由图2可知，当分离胶浓度（添加尿素）为15.5%时电泳分离效果最好，但是酶解液条带不明显，因此将酶解液经超滤和凝胶层析后进行分离，同时考察甘油对电泳效果的影响。SDS-PAGE电泳图谱如图3所示。

图3 SDS-PAGE电泳图谱图

由图3可以看出，在分离胶浓度15.5%条件下，添加甘油的电泳图谱中Maker的5个条带分离效果好，分辨率高。酶解液条带主要呈连续分布状态，但在20 100 Da、14 400 Da和5 856 Da附近处有电泳条带出现，说明该酶解液分子量分布范围较广。经过超滤和凝胶层析纯化后，分子量降低，超滤液条带集中在5 000 Da以下，层析液最高活性组分分子量主要集中在3 000 Da以下，说明降血压肽起抑制效果的活性组分主要在3 000 Da以下。有文献报道，分离胶中添加尿素或甘油可以增加小分子多肽电泳分离的效果，其中尿素的使用与否主要取决于蛋白质的具体性质，有些蛋白没有尿素时分离效果更好，但是有些蛋白的分离就需要添加尿素时才能更好分辨[13]，而在分离胶中添加适量的甘油，由于分离胶交联度不同会对电泳产生一定影响。分离胶的交联度在C=5%时，会改变胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的分子比例使其接近标准的20∶1，凝胶分子之间的结构更紧密，使小分子肽更好地分离，条带更清晰[12]。

3 结论

本文通过优化Tricine-SDS-PAGE电泳条件使得花椒籽蛋白降血压肽得到较好分离，得到的最佳电泳条件为：分离胶浓度为15.5% T、6% C（添加甘油），间隙胶浓度为10% T、3% C，浓缩胶浓度为4% T、3% C，此条件下花椒籽蛋白酶解液电泳泳带分布较广，经纯化后，超滤液分子量在5 000 Da以下，层析液最高活性组分的分子量在3 000 Da以下。