醇沉-苯酚硫酸法测定桑葚酒中多糖含量

◎ 郑若欣，易 啸，罗 爽，吴小娟，吴卫宇

（四川国检检测有限责任公司，四川 泸州 646000）

桑椹是桑科多年生木本植物桑树的果实，俗称桑果、桑枣等[1]，2002年被原卫生部列入保健食品药食同源原料目录。桑椹含有多种活性成分如白藜芦醇、黄酮类、多糖、生物碱、氨基酸、挥发油和原花青素等[2-6]。其中桑葚多糖具有调节免疫功能、抗氧化、抗疲劳等作用[7]。目前桑葚除作为鲜食水果外，通常被加工成果汁、果酒、蜜饯、果酱和果醋等产品。作为新兴产品的桑葚果酒则是以新鲜桑葚和桑葚汁为原料，利用酵母菌将糖发酵转化为酒精等产物，再经陈酿而成的酒质醇厚酒味香甜的果酒产品[8-9]。通过发酵后的桑葚果酒中依然保留部分活性成分，现有的相关研究进展较少。本试验拟通过醇沉浓度、时间、温度3因素的比较建立醇沉-苯酚硫酸法测定桑葚果酒中多糖含量，为桑葚酒的保健功能提供有力的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚酒：市售；葡萄糖对照品：中国药品生物制品检定所；葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖标准品：Dr.ehrenstorfer公司；乙腈为色谱纯；苯酚为优级纯；浓硫酸、无水乙醇为分析纯；高效液相色谱试验用水为一级水，其余均为去离子水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：美国Agilent 1260；色谱柱：美国SepaxHP-Amino（4.6 mm×250 mm，5 μm）；紫外可见分光光度计：HITACHIU-3900；电子天平：赛多利斯CPA225D；高速冷冻离心机：美国Sigma3-18ks；水浴锅：金怡HHS11.4。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

葡萄糖标准溶液（1.0 mg·mL-1）：称取经过98～100 ℃烘箱中干燥2 h后的葡萄糖1 g（精确到0.001 g），加水溶解后定容至1 000 mL。此溶液每毫升相当于1.0 mg葡萄糖；葡萄糖工作溶液：取10.00 mL葡萄糖标准溶液（1.0 mg·mL-1）于100 mL容量瓶中定容，配制为100 μg·mL-1葡萄糖标准使用溶液，现配现用。苯酚溶液：取1 g苯酚于烧杯中，加入15 mL水于40 ℃水浴中溶解，混匀。现配现用；糖标准贮备液（20 mg·mL-1）：分别称取（96±2）℃干燥2 h的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖各1 g，加水定容于50 mL。

1.3.2 最大吸收波长及标准曲线绘制

分别取0 μL、100 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL和1 000 μL葡萄糖工作溶液于10 mL比色管中，以水补齐，加入5 mL浓硫酸，混匀后100 ℃水浴15 min后，冷却，以试剂为空白全波段扫描最大吸收波长后测定吸光度，绘制标准曲线。

1.3.3 样品处理

取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩埚中，60 ℃水浴下挥发至近干，10 mL水溶解转移至50 mL离心管中加入无水乙醇，混匀后低温沉淀，12 000 r·min-1离心10 min后倒出上清液,保留沉淀,加入等体积等浓度乙醇溶液12 000 r·min-1离心5 min，去离子水溶解后定容至25 mL待测。

1.4 检测条件优化

1.4.1 醇沉浓度对桑葚多糖含量测定结果的影响

设置乙醇浓度为70%、75%、80%、85%和90%。分别取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩埚中在60 ℃下挥发至近干，10 mL水溶解转移至离心管中分别加入23.3 mL、30.0 mL、40.0 mL、56.7 mL和 90.0 mL无水乙醇，混匀后4 ℃沉淀16 h后12 000 r·min-1离心10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等体积同浓度乙醇溶液12 000 r·min-1离心5 min，去离子水溶解后定容至25 mL待测。取适量体积待测液测定多糖含量。

1.4.2 沉淀温度对桑葚多糖含量测定结果的影响

分别取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩埚中在60 ℃下挥发至近干，10 mL水溶解转移至50 mL离心管中加入40 mL无水乙醇，混匀后分别置于4 ℃、6 ℃、8 ℃、16 ℃ 和 24 ℃ 沉 淀 16 h，12 000 r·min-1离 心10 min后倒出上清液，保留沉淀，加入等体积80%乙醇溶液12 000 r·min-1离心5 min，去离子水溶解后定容至25 mL待测。取适量体积待测液测定多糖含量。

1.4.3 沉淀时间对桑葚多糖含量测定结果的影响

分别取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩埚中在60 ℃下挥发至近干，10 mL水溶解转移至50 mL离心管中加入40 mL无水乙醇，混匀后4 ℃分别沉淀4 h、6 h、8 h、16 h、24 h 和 48 h，12 000 r·min-1离心 10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等体积80%乙醇溶液12 000 r·min-1离心5 min，去离子水溶解后定容至25 mL待测。取适量体积待测液测定多糖含量。

1.5 醇沉法提取物单糖含量验证分析

取桑葚多糖待测液参照GB 5009.8—2016标准方法[10]测定。流动相：乙腈+水=77+23；流动相流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；示差折光检测器条件：温度40 ℃；等梯度洗脱。

1.6 方法检出限

采用空白标准偏差评估法确定检出限：在490 nm波长下，测20组空白对照溶液的吸光度，求该组值的标准偏差σ，检出限=3σ/k，k为标准曲线斜率。

1.7 方法精密度

分别取6组桑葚果酒25 mL于50 mL瓷坩埚中在60 ℃下挥发至近干，10 mL水溶解转移至50 mL离心管中加入40 mL无水乙醇，混匀后4 ℃沉淀24 h，12 000 r·min-1离心10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等体积80%乙醇溶液12 000 r·min-1离心5 min，去离子水溶解后定容至25 mL待测。取适量体积待测液测定多糖含量，计算精密度。

1.8 方法稳定性

取桑葚多糖待测液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h和48 h按标准曲线方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长与标准曲线

通过全波段扫描苯酚-硫酸法测定多糖的最大吸收波长为490 nm。以葡萄糖质量浓度（μg·mL-1）为横坐标吸光度为纵坐标绘制标准曲线如图1，其线性回归方程为A=0.074 6C-0.002 6，相关系数R2=0.999 6，线性范围为 0 ～ 10 μg·mL-1。

图1 标准曲线图

2.2 检测条件优化

2.2.1 乙醇浓度对桑葚多糖含量的影响

不同乙醇浓度下桑葚多糖提取结果见图2。由结果可知随着乙醇浓度的提高其提取率也随之增加，至80%浓度时达到最大值122 mg·L-1，随后继续提高乙醇浓度桑葚多糖的提取率呈下降趋势。在乙醇沉淀方式下，不同浓度乙醇可沉淀的多糖种类和含量均不同，该方法中80%乙醇浓度可最大程度地提取桑葚果酒中的多糖。

图2 乙醇浓度对得率的影响图

2.2.2 沉淀温度对桑葚多糖含量的影响

不同沉淀温度下桑葚多糖提取结果见图3。由结果可以看出随温度升高桑葚多糖提取率呈逐渐下降趋势。在4～8 ℃其提取率呈缓慢下降，但温度逐渐上升至24 ℃时桑葚多糖含量仅有20.31 mg·L-1，为4 ℃时含量的17%。多糖的溶解度与温度呈正相关性，温度越高溶解度越高，而温度越低多糖溶解度下降与乙醇的沉淀效应越强，因而提取率越高。但是在试验过程中也发现温度不能降至4 ℃以下，提取过程使用的耗材在低温下破裂导致试验不能有效进行。

图3 沉淀温度对得率的影响图

2.2.3 沉淀时间对桑葚多糖含量的影响

不同沉淀时间下桑葚多糖提取结果见图4。由结果可以看出4～24 h时间段随着沉淀时间的增加桑葚多糖得率逐渐提高，24 h得率相较于4 h时提高了近1.7倍，而当沉淀48 h时其得率反而下降。在桑葚多糖的乙醇沉淀体系中，醇沉时间的增长能有效提高沉淀多糖的得率，在一定时间内沉淀时间越长多糖分子之间不断接触逐渐形成较大颗粒沉淀下来，从而提高多糖得率。但试验也证明沉淀时间不能不断延长，当沉淀时间达到48 h时多糖得率反而降低。

图4 沉淀时间对得率的影响图

2.3 醇沉法提取物单糖含量验证

通过单因素试验得到桑葚多糖检测过程提取条件为乙醇浓度80%，醇沉温度4 ℃，醇沉时间24 h。在此条件下提取桑葚多糖得到待测液。通过高效液相色谱分析得到图5检测结果。由高效液相色谱法测定待测液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖，结果均为未检出。由此可以确认该方法能有效的提取出桑葚多糖而无单糖的干扰。

图5 单糖测定结果图

2.4 方法检出限

空白标准偏差评估法测定20组试剂空白，计算20组数据标准偏差为0.002 618，k为0.007 5，由公式计算得方法检出限为1 mg·kg-1。

2.5 方法精密度

通过重复性条件下测定6次桑葚多糖，其结果如表1所示。RSD为2.1%，符合常规试验中相对偏差小于10%要求。通过精密度试验可以看出该方法可重复性较好。

表1 精密度试验结果表

2.6 方法稳定性

对桑葚多糖待测液于不同时间段进行测定，由试验结果如图6，可以看出24 h时内随时间变化其含量值并未发生变化，但时间达到48 h后桑葚多糖含量开始下降。这可能是因为桑葚果酒中可提取多糖含量相对较少，随时间的增加多糖溶解后的均一性开始降低，同时在室温放置下也可能受到微生物的消耗。因此在测定桑葚多糖的检测时，应在提取后24 h内进行检测。

图6 稳定性试验结果图

3 结论

多糖是一类大分子物质，一般不溶于有机溶剂，同时在温度较低时溶解度降低。通过多糖的特性，利用低温条件下的乙醇-水溶液体系中多糖大分子聚合形成微颗粒进而沉淀下来。试验数据表明，随着乙醇浓度的增加桑葚多糖得率不断提高，至80%乙醇时达到最大值，而不同的沉淀温度下，温度越高多糖沉淀能力越低，在低温4 ℃时桑葚多糖得率最大，而沉淀时间则是在时间增加至24 h时桑葚多糖得率最高。提取后的桑葚多糖复水溶解后检测方法选用苯酚-硫酸法，其原理为多糖类成分在浓硫酸作用下水解成单糖，脱水生产糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，从而利用分光光度计进行测定[11]。试验中通过提取条件乙醇浓度、沉淀温度、沉淀时间条件的摸索，建立桑葚多糖的提取分离条件，同时通过高效液相色谱法确认该提取方法中无单糖的干扰，以检出限、方法精密度、稳定性证实该方法的可行性。由试验结果得出，在0～10 μg·mL-1葡萄糖质量浓度范围内，线性结果良好R2=0.999 6，乙醇浓度80%、沉淀温度4 ℃，沉淀时间24 h为提取条件，其方法检出限为1 mg·L-1，精密度为RSD=2.1%，提取液24 h内稳定性良好。醇沉-苯酚硫酸法可作为桑葚果酒中多糖含量的测定方法。