两种β2-受体激动剂荧光免疫快速检测 试纸条的制备及评价

◎ 周 芳，卢俊谕，王帅兵，崔潇婷，卜国瑞，靳世杰

（江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300）

莱克多巴胺（Ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）属于β2-肾上腺素受体激动剂，俗称瘦肉精，该类物质可使多种动物体内的营养成分由脂肪组织向肌肉组织转移，曾被广泛应用于畜禽养殖，有减少脂肪含量、提高瘦肉率的效果。但是过多摄入含此类物质的食物，可导致急、慢性中毒，心率失常等，引发恶性疾病[1-2]。目前，我国已明文规定禁止使用瘦肉精用于动物养殖，但仍有不法商家为追求利益而违法使用。

目前，该类瘦肉精的检测方法较多。①液相色谱、液相色谱与质谱法串联使用是国家标准检测方法[3-6]，但是此类方法需要昂贵的设备，且前处理方法复杂，操作烦琐费时，需要专业人士操作等，所以适用于具有一定实力的监管部门，并不适用于基层执法及食品加工产业链相关企业的自我品质控制。②酶联免疫吸附法[7]具有通量高、易于自动化等优点，很适合大规模的养殖场，缺点是需要专业人员操作，且需要积累到一定的样本量，否则容易造成浪费。③胶体金法[8]具有操作简便、检测快速等优点，缺点是灵敏度欠缺。

近十几年来，基于荧光免疫层析法在人医临床检验领域得到了长足的发展和大规模的应用，兼具操作简便、灵敏度高等优点，但在兽药残留领域应用的并不多[9-12]。目前使用的荧光免疫层析方法更多的是基于荧光微球，本研究拟以荧光染料为标记物，探索一种制备工艺简单且同时对莱克多巴胺、沙丁胺醇进行联合检测的试纸条，便于规模化生产，实现一次检测两种瘦肉精残留，提高检测速度，同时也为基于荧光免疫的其他检测产品的研究与探索提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

沙丁胺醇标准品，购自中国食品药品检定研究院；莱克多巴胺标准品，购自广州优抗多公司；莱克多巴胺抗原、莱克多巴胺抗体、沙丁胺醇抗原、沙丁胺醇抗体，均购自广州优抗多公司；荧光染料CF647，购自biotium公司；羊抗兔IgG、兔IgG，均购自杭州隆基生物；牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20、聚乙二醇2000（PEG20000）、二甲基亚砜（DMSO），均购自国药试剂；硝酸纤维素膜（NC膜），购自Sartorius公司；玻璃纤维、吸水纸、聚酯纤维、PVC底板、检测卡壳，购自上海捷宁公司；空白猪尿，收集于本地屠宰场。

1.2 主要仪器

HM3030划膜喷金仪、ZQ2002斩切机，均购自上海金标公司；AFS-1000荧光免疫分析仪，购自广州蓝勃公司；DHG-9000鼓风干燥箱、DZF-6050真空干燥箱，均购自上海恒一公司；UV-3300分光光度计，购自上海美谱达仪器有限公司。

1.3 试纸条的制备

1.3.1 荧光抗体标记物的制备

取200 μg莱克多巴胺抗体，加入0.1 ng·mL-1碳酸氢钠溶液（pH为8.3）稀释至100 μL，浓度为2 mg·mL-1；将荧光染料CF 647溶解在DMSO中，使其浓度为10 μmol·mL-1，向抗体溶液中加入 20 μL 的荧光染料CF 647溶液，室温孵育1.5 h。沙丁胺醇抗体、兔IgG抗体均使用相同的标记方式进行标记。

在100 mL的0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液（PBS）中用透析膜透析标记后的抗体，12 h更换一次透析液，共透析3次。取透析后的荧光抗体3 μL，用300 μL的PBS稀释100倍，测定在200～700 nm的吸收度，记录最大吸光值，采用公式（1）计算标记率。

式中，A650为荧光染料在650 nm附近的最大吸光峰处的吸光度值，A280为荧光标记抗体在280 nm附近的最大吸光峰处的吸光度值。

1.3.2 结合垫制备

使用含1% BSA、0.05% Tween-20、0.02% PEG20000的PBS对标记后的抗体进行稀释，莱克多巴胺抗体标记物稀释到0.015 mg·mL-1，沙丁胺醇抗体标记物稀释到 0.01 mg·mL-1，兔 IgG 标记物稀释到 0.005 mg·mL-1。以6 μL·cm-1的喷量将稀释后的标记物喷点于聚酯纤维垫上，即为结合垫，放置真空干燥箱中干燥12 h。

1.3.3 NC膜的包被

分别将莱克多巴胺和沙丁胺醇抗原用含1%蔗糖的PBS稀释成1 mg·mL-1的抗原溶液，用划膜喷金仪以1 μL·cm-1的喷量将抗原划线在NC膜上，为检测线，两种抗原的检测线间隔0.4 cm。将羊抗兔IgG用含1%蔗糖的PBS稀释成0.5 mg·mL-1的溶液，靠近最末端检测线外0.4 cm处划控制线，于鼓风干燥箱中37 ℃干燥4 h。

1.3.4 试纸条制备

在PVC底板上先后粘贴包被后的NC膜、结合垫、样品垫、吸水纸。使用斩切机将粘贴好的大板切割成宽度为0.4 cm的试纸条，将试纸条装入检测卡壳中即为检测卡。

1.3.5 检测方法

检测在室温下进行，取80 μL检测样品滴加到检测卡加样孔中，水平放置，在层析作用下，反应复合物沿着NC膜向前移动，包被在膜上的抗原与样本中的莱克多巴胺、沙丁胺醇竞争结合荧光标记的抗体，样本中所含莱克多巴胺、沙丁胺醇越多，膜上聚集的复合物则越少，荧光信号强度越弱；室温反应10 min后，将检测卡插入荧光免疫分析仪中读取检测卡上的荧光信号，计算相应项目的检测线信号与控制线信号的比值（T/C），与检测卡芯片中内置的临界T/C做比较，低于临界T/C的样本为阳性样本，高于临界T/C的样本为阴性样本，从而判断样本中是否含有莱克多巴胺、沙丁胺醇。

1.4 试纸条性能评价

1.4.1 莱克多巴胺浓度与T/C关系曲线测定

取莱克多巴胺标准品，用空白猪尿配制为0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1和 4 ng·mL-1系列浓度的样本，按1.3.5的方法，考察检测莱克多巴胺的浓度与检测T/C的关系。

1.4.2 沙丁胺醇浓度与T/C关系曲线测定

取沙丁胺醇标准品，用空白猪尿配制为0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1系 列 浓度的样本，按1.3.5的方法，考察检测沙丁胺醇的浓度与检测T/C的关系。

1.4.3 检出限的确定

按1.3.5的方法，检测莱克多巴胺浓度为0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1的样本各 30 份，检测沙丁胺醇浓度为 0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、2 ng·mL-1的样本各30份，计算阴性样本的检测T/C均值减3倍标准差，计算阳性样本的检测T/C均值加3倍标准差，阴性样本的T/C均值减3倍标准差应该大于某浓度样本的T/C均值加3倍标准差，则此浓度为本试纸条的检出限。

1.4.4 重复性检测

按1.3.5的方法，检测莱克多巴胺和沙丁胺醇为阴性的样本各30份，检测莱克多巴胺和沙丁胺醇浓度为1 ng·mL-1阳性样本各30份，计算试纸条的变异系数。

2 结果与分析

2.1 荧光标记率

在波长200～700 nm范围内，莱克多巴胺抗体、沙丁胺醇抗体、兔IgG的荧光标记物溶液在280 nm、650 nm处的最大吸光值如表1所示。荧光免疫层析试剂中，抗体上标记的荧光染料个数是关键参数，标记个数太少容易导致荧光信号偏弱，标记个数太多容易影响抗体活性。荧光染料标记抗体试验中通常为一个抗体上标记3～7个荧光染料，本试验抗体上标记的荧光染料个数在5～6个，为较佳标记个数。

表1 荧光标记率结果表

2.2 莱克多巴胺浓度与T/C相关性

莱克多巴胺样本在不同浓度时，其剂量与T/C值的相关性如图1所示，随着浓度的升高，莱克多巴胺的T/C值降低，呈现明显的剂量效应。

图1 莱克多巴胺浓度与T/C相关性图

2.3 沙丁胺醇浓度与T/C相关性

沙丁胺醇样本在不同浓度时，其剂量与T/C值的相关性如图2所示，随着浓度的升高，沙丁胺醇的T/C值降低，呈现明显的剂量效应。

图2 沙丁胺醇浓度与T/C相关性图

2.4 检出限

莱克多巴胺、沙丁胺醇30份阴性样本和不同浓度阳性样本T/C的平均值、标准差（SD）、3倍标准差（3SD）见表2、表3。从表2可知，莱克多巴胺阴性样本的T/C均值减3SD小于0.5 ng·mL-1样本的T/C均值加3SD，但是大于1 ng·mL-1样本的T/C均值加3SD，即说明莱克多巴胺的检出限可达到1 ng·mL-1。从表3可知，沙丁胺醇阴性样本的T/C均值减3SD小于0.5 ng·mL-1样本的T/C均值加3SD，但是大于1 ng·mL-1样本的T/C均值加3SD，即说明沙丁胺醇的检出限可达到 1 ng·mL-1。

表2 莱克多巴胺不同浓度样本检测T/C结果表（n=30）

表3 沙丁胺醇不同浓度样本检测T/C结果表（n=30）

2.5 重复性

检测莱克多巴胺、沙丁胺醇的阴性样本和1 ng·mL-1阳性样本的结果如表4所示，免疫层析检测产品重复性的CV通常在15%～25%，由结果可知本试剂盒检测结果重复性良好。

表4 重复性检测结果表（n=30）

3 结论

动物体内的莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗等这类瘦肉精残留的检测方法较多，常规的国家标准检测方法高效液相色谱法准确但是处理烦琐，检测费用昂贵；随着快速检测技术的发展，陆续开发出一些新型快速的检测方法，酶联免疫检测法、胶体金快速检测法、荧光免疫快速检测法等，每种方法各有其优缺点，在众多的方法中可以根据实际情况，选取满足合适的方法进行检测；这些快速检测方法能够快速筛查出可疑样品，有针对性地采样，提高实验室检测的针对性和准确性，提高监管的效率和检验工作。

本试验探索了荧光免疫层析检测试纸条的一种简易制备方法，用荧光染料代替传统荧光微球直接标记抗体并制备了莱克多巴胺和沙丁胺醇二联检测免疫层析试纸条，对试纸条的性能做了初步的评价，检测限可达1 ng·mL-1，精密度符合要求，具有灵敏度高，检测速度快的特点，通过荧光定量仪读取结果，使用方便快捷。

随着国家对食品安全监管的加强及人们食品安全意识的提高，对食品安全领域快速检测技术的发展要求也越发强烈，试验中探索的荧光素直接标记方法制备瘦肉精荧光免疫快速检测的试剂条，具有制备方法简易、成本相对低廉等优势，适合大规模生产，有利于促进快速检测技术理念在食品安全领域的推广，保障老百姓的食品安全。