太芪培元颗粒对免疫低下小鼠T细胞亚群、NK细胞计数及巨噬细胞吞噬作用的影响研究❋

曾 琳， 马秀兰△， 马建萍， 李静茹， 张 颖， 艾合买提·阿布都热依木

(1.新疆医科大学附属中医医院艾滋病研究室， 乌鲁木齐 830000；2.新疆名医名方与特色方剂学实验室， 乌鲁木齐 830000)

艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一种由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的、以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病。太芪培元颗粒是新疆医科大学附属中医医院的院内制剂，用于治疗气阴两虚、肺肾不足型的艾滋病患者。该药物自2008年起开始在临床应用，通过临床疗效观察，该方可以明显改善患者症状体征，提升部分患者的CD4+T细胞水平，提高生存质量[1-5]。观察太芪培元颗粒对免疫低下小鼠外周血T细胞亚群含量、自然杀伤细胞(NK)计数及巨噬细胞吞噬作用的影响，初步探索该药可能的作用机制。本研究已获新疆医科大学实验动物伦理审查委员会批准，批准号2018-0013-01。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性BALB/c小鼠120只，每只18～22 g，由新疆医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证号SYXK(新)2018-0003。饲养期间室内温度22 ℃，湿度58%～70%之间，喂饲辐照灭菌BALB/c小鼠饲料，给药前禁食12 h，自由饮水。

1.2 药物制备

太芪培元颗粒用水煎、醇沉等现代工艺和方法制成浸膏，由新疆维吾尔自治区中医医院药剂室提供；黄芪颗粒(4 g×12袋，四川百利天恒药业股份有限公司，国药准字Z20003380)；环磷酰胺(0.2 g×10瓶，山西普德药业股份有限公司，国药准字H14023686)。

1.3 试剂与仪器

甲醇-丙酮固定液(1∶1，批号G2155)，索莱宝公司；吉姆萨染液(10×原液，批号G1015)，索莱宝公司；红细胞裂解缓冲液(RBC Lysis Buffer)(1×)、溶血素,eBioscience公司；PE anti-mouse CD49b,pan-NK cells公司；FITC anti-mouse CD3、PerCP anti-mouse CD8a、APC anti-mouse CD4，biolegend公司。

LC-4016低速大容量离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；BriCyte E6流式细胞仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；Axio Observer A1荧光倒置显微镜(德国蔡司公司)；BSC-150恒温恒湿箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；XS-800i全自动血液分析仪(日本 Sysmex 公司)。

1.4 动物模型建立

雄性实验小鼠120只，动物适应性饲养1周。其中20只小鼠正常饲养为对照组；其余100只小鼠均采用每只每天腹腔注射25 mg环磷酰胺注射液进行造模；连续腹腔注射7 d后，随机取空白对照和模型对照各10只，测血常规、脾脏和胸腺指数，以检测造模成功与否。在灌服药物期间，每周小鼠腹腔注射一次20 mg环磷酰胺注射液，以维持免疫低下状态。

1.5 分组与给药

将造模成功的90只小鼠随机分为模型组、黄芪颗粒组、太芪培元颗粒高剂量组、太芪培元颗粒中剂量组、太芪培元颗粒低剂量组5组各18只。按照“实验动物与人按体表面积比等效剂量换算比率表”[6]，计算小鼠每日给药剂量。依据人体质量(60 kg)与实验小白鼠体表面积比换算和设定为小鼠的太芪培元颗粒中剂量。造模成功后开始给药，具体给药方式为：正常组、模型组小鼠给予等量生理盐水进行灌胃；中药对照组黄芪颗粒用双蒸水配成溶液，使用13.3 mg·kg-1·d-1水溶液进行灌胃；药物干预高、中、低剂量组大鼠给予太芪培元颗粒水煎液灌胃，剂量分别为33.26、16.63、8.32 g·kg-1·d-1，每日灌胃1次，连续28 d。

1.6 血常规检测

随机选取各组小鼠6只，使用l%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为40 mg/kg；采用眼球摘除法分别收集50 μL血液置EDTA抗凝采血管中进行血常规检测。

1.7 胸腺系数和脾脏系数检测方法

随机选取各组小鼠8只与流式细胞一起取材，暨收集外周血后处死小鼠立即称体质量、胸腺和脾脏质量，计算如下指标。胸腺系数=小鼠胸腺质量 (mg)/小鼠体质量 (g)，脾脏系数=小鼠脾脏质量 (mg)/小鼠体质量 (g) 。

1.8 流式细胞测定外周血T细胞亚群及NK细胞

随机选取各组小鼠8只，使用l%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为40 mg/kg；采用眼球摘除法分别收集外周血50 μl置含EDTA抗凝采血管中，轻柔颠倒摇匀；每个流式检测管分别加入100 μl全血标本，加入相应的流式抗体，避光孵育30 min，每管分别加入1 ml红细胞裂解液颠倒混匀，室温避光孵育5 min，1200 r/min低速离心5 min弃去上清；2 ml PBS缓冲液洗涤细胞1次，1200 r/min低速离心5 min，500 μl PBS缓冲液重悬细胞进行流式细胞测定。

1.9 巨噬细胞吞噬能力测定

随机选取各组小鼠4只，无菌注射器吸取3%硫代乙醇酸钠3 ml，注射于小鼠腹腔内；4 d后分别给各组小鼠腹腔注射1 ml 1%羊红细胞悬液；1 h后颈椎脱臼法将小鼠处死，解剖暴露腹腔，于腹腔靠上部位用镊子轻轻夹起腹膜，将腹膜剪一小口，用尖吸管注入5 ml预温的PBS，同时反复揉搓腹腔约1～2 min，以便尽可能多地冲洗出小鼠腹腔的吞噬细胞。用尖吸管吸取腹腔液，置一洁净试管内吹打均匀；干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，向其中滴加一滴腹腔液，37 ℃恒温恒湿箱中孵育60 min；孵育完成后取出玻片，吸去液体；用1∶1丙酮、甲醇溶液固定5 min后，4%吉姆萨染液染3 min，清水冲洗晾干后显微镜观察、拍照。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠的一般情况

空白组大鼠未见异常, 体质量逐日增加, 摄食量、饮水量增加，毛色有光泽。造模后第4天，造模小鼠均出现毛色发暗、脱毛、喜卧等现象，各给药组在服药后1周后一般情况均较模型组有所好转。

2.2 各组小鼠血常规、脾脏和胸腺指数比较

表1示，与空白组比较，模型组淋巴细胞、单核细胞、脾脏指数、胸腺指数均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；太芪培元颗粒各剂量组、黄芪颗粒组白细胞、中性粒细胞均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；太芪培元颗粒中剂量组与高剂量组淋巴细胞、单核细胞均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明各治疗组及黄芪颗粒组均有升高白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的作用，与黄芪颗粒组比较，太芪培元颗粒高剂量组升高中性粒细胞、单核细胞更明显。

表1 血常规、脾脏和胸腺指数比较

2.3 外周血T细胞亚群及NK细胞计数比较

表2图1示，外周血T细胞亚群结果显示：与空白组比较，模型组NK细胞计数降低，差异有统计学意义(P<0.05)。太芪培元颗粒高剂量组CD8+T淋巴细胞计数较模型组低，CD4+/CD8+比值显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。表2图2、3示，NK细胞计数结果显示，各治疗组NK细胞比例显著高于模型组(P<0.05)，说明各治疗组均有提高NK细胞的作用，与黄芪颗粒组比较，太芪培元颗粒高剂量组NK细胞升高更加明显，而且能够降低CD8+T淋巴细胞计数、升高CD4+/CD8+比值。

表2 各组间流式结果比较分析

图1 外周血CD4+/CD8+ T细胞比例

图2 NK细胞计数比例

图3 (CD3-CD49+)NK细胞流式检测图

2.4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定

图4示，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力检测结果示，各组之间巨噬细胞吞噬能力比较差异无统计学意义。

图4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能比较

3 讨论

HIV病毒本身并不会引发任何疾病，而是将人体免疫系统中最重要的T细胞作为攻击目标，对其大量破坏，最终使免疫系统崩溃，使人体因丧失对各种疾病的抵抗力而发病。本研究采用环磷酰胺腹腔注射，也是造成小鼠免疫系统的破坏，并且在试验过程中维持给药，造成免疫系统持续损害状态，是目前公认、合理、方便易行的免疫抑制小鼠造模方式。

T细胞表面CD4分子是HIV感染的天然受体，也是HIV攻击的最主要靶细胞。HIV感染不仅造成外周血CD4+T细胞数量减少,并且导致其功能障碍,是HIV/AIDS的主要改变之一[7]。CD8+为抑制性T淋巴细胞 (Ts),其含量越高免疫抑制越强, 机体的抵抗力越弱[15]。CD8+T细胞不仅在自然老化过程中累积增加，在无临床症状的HIV成年人体内显著增加。近年来的研究发现，除了T细胞，巨噬细胞也经历了功能性极化。巨噬细胞对病毒的细胞毒性作用耐受能力很强[8-10]，因其在HIV-1感染中可以长久地存活并释放病毒，成为重要的储存库部位。NK细胞是一类固有免疫细胞[11]，研究表明，NK细胞具有免疫清除作用，即细胞毒作用、诱导凋亡作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用；同时具有免疫调节作用，NK细胞可通过识别和杀伤能够逃避细胞毒性T细胞杀伤作用的肿瘤细胞或病毒感染细胞,主要通过释放干扰素、穿孔素、颗粒酶、补充细胞毒性T细胞等产生直接的细胞杀伤作用[12]。HIV感染后NK细胞与疾病进展相关，HAART可部分恢复NK细胞，治疗前NK细胞水平与HAART免疫应答相关[13]。最近对猴免疫缺陷病毒感染的猕猴和 HIV 感染者的研究发现，存在B细胞滤泡中的NK细胞可抑制病毒复制、清除储存库，为病毒储存库的清除提供新的研究方向。随着对 NK 细胞研究的深入，其在HIV感染中发挥的作用也越来越受到重视。

太芪培元方即平艾合剂1号方，主要用于治疗艾滋病证属气阴两虚、肺肾不足者，临床表现为低热或五心烦热或夜间潮热、盗汗或自汗、乏力气短等。方中以太子参、生地为君药。太子参味甘微苦，归脾、肺经，补气生津；生地味甘、苦、性寒，归心、肝、肺经，具有养阴生津、清热凉血作用，两药重用共奏益气养阴之功。该方为新疆维吾尔自治区中医医院院内制剂，临床观察发现，该药物可以明显改善患者的临床症状，提高部分患者的CD4+T细胞水平和生存质量[1-5]。但是体外试验显示，该药物体外抗HIV-1病毒的作用不明显[14]。黄芪含多种有益成分，研究证实黄芪多糖类和黄芪皂苷类物质具有调节免疫功能的作用，改善生存质量具有较好作用[15]，因此将黄芪颗粒选为阳性对照组。

本试验研究结果显示，太芪培元颗粒能够提高NK细胞数量及CD4+/CD8+比值，降低CD8+数量，提升白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞数量，且太芪培元颗粒高剂量组改善免疫及提升血常规含量明显优于其他各组。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力测定虽然无统计学意义，但从图片可以看出，太芪培元颗粒高剂量组对巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象要高于空白组。基于此，该药物对提高免疫功能的改变，可能为通过抑制CD8+T细胞计数及增加NK细胞数量而实现，但是相关影响机制仍需要进一步的试验研究进行论证。