山楂叶金丝桃苷对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用❋

杨 莺， 姚新月， 李海波

(1.辽宁中医药大学附属医院， 沈阳 110032； 2.辽宁中医药大学研究生部， 沈阳 110847；3.辽宁中医药大学基础医学院， 沈阳 110847)

炎症是指机体受到外界刺激时所产生的防御反应，正常情况下炎症有利于清除致病炎症因子。但过度的炎症反应可导致机体组织损伤使病情加重，如神经退行性疾病、动脉粥样硬化、关节炎等[1-2]。迄今在临床使用的抗炎药主要包括甾体抗炎药(如地塞米松)和非甾体抗炎药(如阿司匹林)。但因为其诸多不良反应(如引起类肾上腺皮质功能亢进症、严重的胃肠道反应等)，限制了其在临床的应用[3-4]，因此研发高效、低毒的抗炎药物是目前研究的重点。

山楂又称山里红，来源于蔷薇科植物山里红或山楂的干燥成熟果实，具有消食健胃、行气散瘀之功效[5]。山楂叶富含黄酮类化合物，其中金丝桃苷(hyperoside, Hyp)是其主要活性成之一，具有广泛的药理活性，主要包括抗氧化、抗肿瘤、抗缺血性脑卒中等[6-9]。但是Hyp能否通过激活Sirt6抗炎作用未见报道。因此，本研究拟采用脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7炎症损伤，探索山楂叶提取物金丝桃苷是否通过调控Sirt 6发挥抗炎作用，为其临床用于抗炎症相关疾病提供药理学依据。

1 材料

1.1 药物

图1示，山楂叶提取物金丝桃苷(Hyp)由遵义医科大学高建美教授赠予，纯度 ≥98%。采用二甲基亚砜溶解Hyp后配成10 mmol.L-1母液，在超净台内采用0.22 μmol/L微孔滤器过滤除菌，-20 ℃冻存备用。

图1 Hyp高效液相色谱图

1.2 细胞培养

RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞研究所，采用含10%胎牛血清RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 试剂与仪器

RPMI1640培养液(#8116408)，Gibco公司；LPS(#L2630)、MTT(#M2128)，Sigma公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(#20171015)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)(#20171015)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)(#20171123)、诱导型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase, iNOS)(#20171123)、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，上海江莱上海江莱生物科技有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 和iNOS及 β-actin引物合成、Trizol和DEPC，上海生工生物工程股份有限公司；anti-p-p38 (#ab47363) 多克隆抗体、anti-p38(#ab170099)多克隆抗体、anti-p-核转录因子κB p65(nuclear factor-κB, NF-κB p65)(#ab86299)多克隆抗体、anti- NF-κB p65多克隆抗体(#ab16502)、沉默信息调节因子6(sirtuin 6, Sirt6, #ab88494)，Abcam公司。

二氧化碳培养箱(Thermo Fisher Scientific公司)；CFX96型RT-PCR仪 (Bio-Rad公司)；DDY-10型三恒电泳仪(Bio-Rad公司)；半干转印槽(Bio-Rad公司)；全自动电泳凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 Hyp对RAW264.7细胞活力的影响 将处于对数生长期的RAW264.7细胞以1×105个/ml接种于96孔培养板中，加入不同浓度的Hyp(0 μmol/L, 1.563 μmol/L, 3.125 μmol/L, 6.25 μmol/L, 12.5 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L)作用24 h确定Hyp的安全浓度范围；将RAW264.7细胞随机分为正常对照组、模型组、模型组+ Hyp低浓度组、模型组+ Hyp中浓度组、模型组+ Hyp高浓度组、模型组+ 地塞米松组。LPS(1 μg/ml)和不同浓度(25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L)的Hyp或地塞米松(20 μmol/L)作用24 h后，加入MTT(5 mg/L)继续培养24 h后弃上清，每孔加入DMSO(150 μL)，振摇10 min，于570 nm波长处测定吸光度值。

1.4.2 Hyp对LPS诱导的RAW264.7细胞内NO含量的影响 RAW264.7细胞按照1.4.1项方法处理后取上清，采用Griess法检测细胞内NO含量，取50 μL上清液与等体积的Griess试剂混合，在室温下培养15 min。在540 nm波长的条件下检测吸光度，并利用已知浓度的亚硝酸钠作为标准，计算各组对应的实际浓度值。

1.4.3 Hyp对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子释放的影响 RAW264.7细胞按照1.4.1项方法处理后取上清，采用ELISA法测定NO和TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS含量，严格按照试剂盒说明操作。取40 μL稀释液与10 μL上清液混合，置于37 ℃条件下反应 30 min后，将浓缩液稀释按照要求稀释用于洗涤各孔；移取50 μL酶标液加入各孔充分反应30 min(37 ℃条件下)；移取50 μL A、B显色剂，37 ℃环境下反应20 min(尽量避光)；移取50 μL终止液加入反应；在波长为450 nm条件下测定样本的OD值。

1.4.4 Hyp对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子mRNA水平的影响 RAW264.7细胞按照1.5.1项方法处理后，收集细胞提取RNA，逆转录合成cDNA，通过RT-PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA表达，引物序列如表1所示。RT-PCR反应条件如下：95 ℃变性5 min、60 ℃变性30 s、72 ℃延伸20 s条件扩增40次。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算炎症因子mRNA水平。

表1 炎症相关因子的基因引物序列

1.4.5 Hyp对LPS诱导的RAW264.7细胞Sirt 6表达和NF-κB p65磷酸化水平的影响 RAW264.7细胞按照1.5.1项方法处理，收集细胞后采用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白变性后，上样20 μg蛋白，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗p38(1∶1000)、Sirt6 (1∶1000)、p-NF-κB p65(1∶1000)和NF-κB p65(1∶1000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，加入二抗(1∶5000)封闭1 h后，采用ECL显影，以Image J统计灰度值。

1.4.6 计算机虚拟分子对接检测Hyp与p38的亲和力 采用Autodock 4.2以及AutodockTools软件进行分子虚拟对接，观察Hyp及p38的亲和力情况。从Protein Data Bank (http://www.rcsb.org) 数据库获取p38蛋白的pdb格式文件，其PDB ID为1ZZL。采用Autodock 4.2分别对Hyp与p38蛋白进行分子对接。

1.4.7 流式细胞术检测细胞周期和凋亡变化 将细胞按照1.4.1描述的方法处理后，收集细胞加入70%预冷的乙醇溶液4 ℃条件下孵育过夜后，加入50 mg/ml的碘化丙啶染色液及100 mg/ml RNase A，在室温条件下避光孵育15 min后，用流式细胞仪检测各组细胞周期和凋亡改变。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 Hyp对RAW264.7细胞活力的影响

图2示，Hyp(0 μmol/L, 1.563 μmol/L, 3.125 μmol/L, 6.25 μmol/L, 12.5 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L)单独处理或与LPS共同作用均对RAW264.7细胞活力无影响；而Hyp(200 μmol/L, 400 μmol/L)单独处理或与LPS共同作用均明显抑制细胞活力；表2、3示，各组细胞形态无明显改变，与MTT研究结果一致，表明Hyp在浓度100 μmol/L以下为其安全范围(P<0.05)。

注：不同浓度Hyp作用24 h后，采用MTT法检测细胞活力。 A.正常对照组；B. LPS组；C. Hyp (25 μmol/L)；D. Hyp (50 μmol/L)；E. Hyp (100 μmol/L)；F. 地塞米松(放大400×)

表2 Hyp对RAW264.7细胞活力的影响

2.2 Hyp对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子释放的影响

表4示，LPS(1 μg/ml)刺激RAW264.7细胞后，NO、TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量较正常对照组明显升高。Hyp(25、50、100 μmol/L)和阳性药地塞米松组能够明显降低NO、TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量，并呈浓度依赖性(P<0.05)。

表3 Hyp和LPS共同作用对RAW264.7细胞活力的影响

表4 Hyp对 LPS 诱导RAW264.7细胞炎症因子NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的影响

2.3 Hyp对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子mRNA水平的影响

表5示，研究结果表明，LPS(1 μg/ml)刺激RAW264.7细胞后，TNF-α、IL-1β、IL-6和 iNOS的mRNA水平较正常对照组明显升高。Hyp(25、50、100 μmol/L)和阳性药地塞米松组能够显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6和 iNOS的mRNA水平，并呈浓度依赖性(P<0.05)。

表5 Hyp对LPS 诱导RAW264.7细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA水平的影响

2.4 Hyp对LPS诱导的RAW264.7细胞Sirt 6表达和NF-κB p65磷酸化水平的影响

图3表6示，LPS明显增加p-NF-κB p65水平，降低Sirt6的蛋白表达。而Hyp显著降低p-NF-κB p65水平，增加Sirt6的蛋白表达(P<0.05)。

表6 Hyp对LPS诱导RAW264.7细胞Sirt 6表达与NF-κB p65磷酸化水平的影响量化比较

注：1：正常对照组；2. LPS组；3. Hyp (25 μmol/L)；4. Hyp (50 μmol/L)；5. Hyp (100 μmol/L)；6. 地塞米松

2.5 Hyp结合并抑制p38蛋白

图4示，采用模拟分子对接方法评价Hyp与p38蛋白结合情况的对接结果显示，Hyp能够与p38结合，两者的结合能为-6.05 kcal/mol。Hyp与p38蛋白对接具有丰富的氨基酸残基，主要包括Asp168、Lys53、His107、Tyr35、Leu167等，提示Hyp可能直接作用于p38发挥抗炎作用。

注：A.Hyp与p38结合表面的可视化结果；B-C.Hyp与p38结合位点的可视化结果；D.Hyp与p38对接的氨基酸残基位点可视化结果

2.6 Hyp对LPS诱导的RAW264.7细胞周期和凋亡的影响

图5示，与空白组比较，LPS明显诱导RAW264.7细胞凋亡，且S期细胞显著增加；与模型组比较，Hyp可显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞凋亡，且S期细胞明显减少，提示Hyp能够明显抑制LPS诱导RAW264.7细胞凋亡。

注：A.正常对照组；B. LPS组；C. Hyp (25 μmol/L)；D. Hyp(50 μmol/L)；E. Hyp (100 μmol/L)；F. 地塞米松

3 讨论

巨噬细胞是参与炎症反应的重要免疫细胞，在外界因素(如LPS)刺激的情况下可产生炎症因子[10-11]。LPS为革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，能够刺激巨噬细胞释放炎症因子(如NO、TNF-α等)[12-13]。其中，NO广泛存在于生物体内，过度的炎症反应可产生iNOS，进而合成大量NO而导致细胞损伤。TNF-α、IL-1β、IL-6为炎症反应中的主要炎症因子，是反应炎症水平的重要指标。本研究结果表明，LPS明显增加RAW264.7细胞NO、TNF-α、IL-1β、IL-6释放量，与文献报道一致[14]。而山楂叶提取物Hyp能够明显减少RAW264.7细胞NO、TNF-α、IL-1β、IL-6释放量，表明山楂叶提取物Hyp具有明显的抗炎作用，但其作用机制有待于进一步探讨。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族在炎症反应过程中发挥着重要作用，p38 MAPK是其家族重要成员之一。据文献报道，p38 MAPK在炎症刺激下被磷酸化后激活其下游基因NF-κB发挥作用[15]。NF-κB是炎症反应过程中重要的基因转录调控因子，其家族成员主要包括p65和p50。正常生理情况下，NF-κB(p50/p65)以异二聚体形式存在于细胞质中；在炎症(如LPS)刺激条件下，NF-κB信号通路被激活后NF-κB-p65由细胞质移位至细胞核，进而促进TNF-α、IL-6 、IL-1β、iNOS等炎性因子的释放。本研究结果显示，LPS能够通过磷酸化使磷酸化p38 MAPK，继而激活其下游的NF-κB p65，进而上调TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA水平，与文献报道一致[16]。而山楂叶提取物Hyp能够明显抑制p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平，并显著下调TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA水平。沉默信息调节因子6(silent information regulator 6，Sirt 6)是SIR2家族的重要成员之一。最近文献报道，Sirt 6不仅具有抗氧化作用，还可调控NF-信号转录，进而抑制炎症因子的释放[17]。本研究结果显示，LPS能够明显降低Sirt6的蛋白表达，与文献报道一致[18]。而山楂叶提取物Hyp可明显增加Sirt6的蛋白表达，提示山楂叶提取物Hyp可以通过抑制p38 MAPK磷酸化，激活Sirt6进而调控NF-κB炎症通路发挥作用。值得注意的是，分子对接结果表明，山楂叶提取物Hyp能够与p38 MAPK结合并通过氨基酸残基Asp168、Lys53、His107等发生相互作用，提示p38 MAPK可能为山楂叶提取物Hyp作用的潜在靶点。值得注意的是，Hyp能够显著抑制LPS诱导的细胞凋亡，并使其阻滞在S期，但其抗凋亡的作用机制有待于进一步探索。此外，本研究只是初步探讨了在体外实验中Hyp的抗炎作用可能与抑制p38 MAPK磷酸化和激活Sirt6进而抑制NF-κB p65的磷酸化，从而抑制炎症因子的释放有关，其具体的作用机制还有待于在体内动物实验中进一步验证。

综上，在本实验条件下，Hyp具有抗LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应的作用，其作用可能与调控p38 MAPK/Sirt6/NF-κB信号通路相关。本研究旨在为将Hyp研发为抗炎药物应用于临床治疗炎症相关疾病提供重要参考。