肾康灵对慢性肾脏病小鼠肾功能和自噬水平的影响

庄翔莉 艾 斯 郑 健

(1.福建中医药大学中西医结合研究院 福建福州 350122；2.福建中医药大学附属人民医院 福建福州 350004；3.福建中医药大学中医儿科研究所 福建福州 350122)

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是威胁全世界公共健康的主要疾病之一。CKD所致的肾功能下降呈不可逆性发展，并将逐渐进展至终末期肾病[1]，严重影响患者生活质量，且消耗了巨大的社会医疗资源。近年研究发现[2]，自噬与CKD、肾缺血再灌注等急性肾损伤、药物性肾损害、遗传性肾脏病、糖尿病肾病等肾脏疾病的发病及肾脏衰老有关。因此，自噬未来可能作为治疗肾脏疾病的一个新靶点。益肾活血中药肾康灵是福建省名老中医王著础治疗肾病五十多年的临床经验方，具有益肾气、行气血、化瘀血之功效，临床验证疗效显著[3][4]，但其具体作用机制仍有待进一步完善。因此，本研究通过建立腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型，观察肾康灵对CKD小鼠肾功能和肾脏自噬水平的影响，进一步探讨肾康灵CKD肾损伤的保护机制，为肾康灵在CKD中的临床应用提供实验依据。

一、实验材料

（一）实验动物

C56BL/6小鼠24只，鼠龄6～8周，体质量（22±2）g，订购于上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证号SCXK（沪）2017-0012。实验动物均饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级屏障系统，许可证号SYXK（闽）2019-0007。实验过程中严格根据中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》处置实验动物。

（二）实验药物

肾康灵组方为黄芪30g，生地黄15g，山茱萸9g，山药12g，茯苓9g，牡丹皮15g，三七9g等，经煎煮、过滤、离心、浓缩至生药浓度为1.5g/mL的药液，由福建中医药大学附属人民医院制剂室制备。

（三）实验试剂与仪器

腺嘌呤（A8626，美国Sigma公司）；4%多聚甲醛（BL539A，北京白鲨生物）；HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒（G1120、G1346，北京索莱宝公司）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL（P0012A、P0018S，上海碧云天生物）；封闭液、转膜液（KGP108、KGP102，江苏凯基生物）。RM2235石蜡切片机（德国Leica公司）；DMIL/DFC295倒置显微镜（德国Leica公司）；PowerPac Universal电泳仪（美国BIO-RAD公司）；ChemiDoc XRS+化学发光成像分析仪（美国BIO-RAD公司）。

二、实验方法

（一）动物模型制备及分组给药

24只C56BL/6小鼠，适应性喂养7天后，根据性别和体质量分层随机化原则分为正常组、模型组和肾康灵组各8只。采用腺嘌呤诱导法[5]复制CKD小鼠模型：予模型组和肾康灵组小鼠喂食含有0.25%腺嘌呤（w/w）的饲料，正常组喂食等量普通饲料，共喂养28天，期间自由饮水。实验第29天，肾康灵组经胃灌服肾康灵溶液1mL/100g，正常组和模型组均经胃灌服生理盐水1mL/100g，各组连续灌胃14天。

（二）标本采集

各组小鼠末次给药后，禁食不禁水12h，予2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉后各小鼠予眼球摘除取血，3500rpm/min离心20min后分离上层血清，用于肾功能检测；背部切口摘除肾组织，剥离肾外包膜后，沿冠状面切开，取1/2右肾组织浸泡于4%多聚甲醛中用于光镜制样观察，其余肾组织投入液氮速冻后转移至-80℃保存，用于蛋白水平检测。

（三）指标观察与检测

1.肾功能检测

使用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）的浓度。

2.肾组织病理学观察

4%多聚甲醛固定2天，取出肾组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，予4μm厚度切片，行HE染色和Masson染色，用于观察小鼠肾组织病理形态变化。

3.Western blot法检测肾组织自噬相关蛋白表达

RIPA裂解液提取肾组织样本总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，各组蛋白定量后行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后，于室温封闭1h，4℃孵育一抗过夜，再室温孵育二抗1h，以TBST充分洗膜，行ECL化学发光法显影成像，以β-actin为内参，分析各目的蛋白表达水平。

（四）数据统计分析

三、实验结果

（一）肾功能指标比较

见表1。

表1 3组小鼠BUN、Scr含量比较（n=8，±s）

表1 3组小鼠BUN、Scr含量比较（n=8，±s）

注：与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 BUN（mmol/L） Scr（μmol/L）正常组 10.91±1.39 13.24±1.91模型组 31.36±9.02▲▲ 35.81±9.79▲▲肾康灵组 12.89±1.69△△ 15.49±1.89△

（二）肾组织病理学变化

采用HE染色法观察CKD小鼠肾脏病理变化，结果显示，正常组小鼠肾小球和肾小管结构完整，形态均匀，未见明显病理损伤；模型组小鼠肾小球系膜增生，肾小管管腔扩张、细胞肿胀变性；肾康灵组小鼠肾小球、肾小管病变程度较模型组明显减轻。见图1。

采用Masson染色法观察CKD小鼠肾脏纤维化程度，结果显示，正常组小鼠肾小球无明显变化，肾小管管腔无明显代谢物沉积，肾间质中仅有少量蓝色胶原纤维呈条索状沉积；模型组小鼠肾小球球囊明显扩张，基底膜明显增厚，有大片蓝色胶原纤维沉积在肾小管间质及上皮；肾康灵组小鼠上述纤维化程度明显减轻。见图2。

图1 各组小鼠肾组织HE染色结果（×400）

图2 各组小鼠肾组织HE染色结果（×400）

（三）肾组织自噬相关蛋白表达水平比较

与正常组小鼠比较，模型组小鼠肾组织P62表达水平显著降低，Atg5和LC3Ⅱ表达显著升高（P均＜0.01）。与模型组小鼠比较，经中药肾康灵干预后，CKD小鼠肾组织的P62表达显著上调（P＜0.05），Atg5和LC3Ⅱ表达显著下调（P＜0.05，P＜0.01）。见图3、表2。

图3 各组小鼠肾组织自噬相关蛋白表达条带图

表2 各组小鼠肾组织自噬相关蛋白表达水平（n=5，±s）

表2 各组小鼠肾组织自噬相关蛋白表达水平（n=5，±s）

注：与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 P62/β-actin Atg5/β-actin LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ正常组 0.72±0.08 1.18±0.08 1.70±0.16模型组 0.36±0.16▲▲ 1.77±0.40▲▲ 2.37±0.22▲▲肾康灵组 0.58±0.21△ 1.36±0.19△ 1.80±0.41△△

四、讨论

自噬是普遍存在于真核细胞中的一种依赖溶酶体的胞内降解系统，能够清除细胞中损伤或衰老细胞器及生物大分子，是一种高度保守的维持自身稳态的重要调节机制。近年来越来越多研究表明，自噬参与了肾脏的疾病、修复和衰老过程。P62、Atg5和LC3Ⅱ是自噬体形成过程中的关键分子[6]。自噬体形成时，LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ，P62蛋白则选择性地与LC3Ⅱ直接结合并被自噬体包裹降解[7]。而自噬相关蛋白Atg5可与Atg12、Atg16L1形成多聚体，参与LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化，从而进一步参与自噬泡双层膜的形成[8]。

中药肾康灵是根据CKD肾虚血瘀的病理特点而研创的临床经验方。研究结果表明，CKD小鼠BUN和Scr显著升高，肾组织呈现纤维化病变，Atg5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平明显升高，P62蛋白水平明显下降，提示自噬参与了CKD小鼠肾损伤的过程。经肾康灵干预治疗后，CKD小鼠肾功能显著缓解，肾组织纤维化程度减轻，Atg5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达下降，P62蛋白表达显著升高，提示肾康灵可能通过抑制自噬流发生，从而改善CKD肾损伤，最终延缓CKD进展。其作用机制尚需在体外实验中进一步验证。