GC-MS法测定头孢泊肟酯中的氯甲烷和氯乙烷

白青山，田朋鑫

(临沂市检验检测中心，山东 临沂 276000)

头孢泊肟酯是第3代口服头孢菌素,对成人和儿童的各种细菌性感染疾病均有较好疗效[1-2]。头孢泊肟酯生产过程中使用了甲醇、乙醇等有机溶剂，可能会与工艺中使用的盐酸反应生成基因毒性杂质氯甲烷和氯乙烷。该类杂质的反应活性很活泼，可以直接与DNA发生烷基化反应[3]，从而抑制细胞生长，启动程序性细胞凋亡[4-5]。此类杂质虽微量，但依然可能产生致癌风险，因此需要严格控制[6-7]。目前关于头孢泊肟酯的含量测定、有关物质以及溶剂残留的研究已有较多文献报道[8-11]，但尚未有针对头孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷测定的研究。因此，探索头孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷的定量分析方法是对其检验标准的进一步完善探讨。本文旨在建立一种操作简单、准确度高的头孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷的测定方法，为其用药安全及相关研究提供一个新的思路和实验基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 气相色谱-质谱联用仪(岛津公司)，配QP2010PLUS质谱检测器，GCMS Solution工作站。

1.2 试剂 氯甲烷对照品(TCI，批号：U3VTF，含量：5.6%,W/W)；氯乙烷对照品(TCI，批号：8GAYA，含量：15.1%，W/W)；氯丙烷对照品(TCI，批号：62R4N-GA，含量：99.0%)；N,N-二甲基甲酰胺(色谱级，上海星可高纯溶剂有限公司)；头孢泊肟酯(SR有限公司，批号：1902028001、1903028001、1903028002)。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件 (6%-氰丙基苯基)-94%甲基聚硅氧烷为固定液(MEGA，MEGA-624MS，60 m×0.25 mm，1.4 μm)的毛细管柱；程序升温过程：初始柱温为40 ℃维持9 min，以50 ℃·min-1速率升温至230 ℃，维持7 min；进样口温度：250 ℃；载气为氦气；流速为线速度模式，柱流速2 mL·min-1；分流进样，分流比10∶1；顶空瓶平衡温度80 ℃，定量环温度110 ℃，传输管线温度120 ℃，平衡时间25 min。

2.1.2 质谱条件 采用电子轰击电离源(EI)，离子源温度：200 ℃，接口温度：200 ℃，检测离子(m/z)为50、64、78。

2.2 溶液配制

2.2.1 氯甲烷、氯乙烷贮备溶液 精密量取氯甲烷、氯乙烷对照品各1 mL置500 mL量瓶中，用50% N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶解并定量稀释至刻度，摇匀；精密量取25 mL置100 mL量瓶中，用50%DMF溶液定量稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 内标贮备溶液 精密称取氯丙烷对照品104.58 mg，置25 mL量瓶中，用50%DMF溶液溶解并定量稀释至刻度，摇匀；精密量取2 mL置50 mL量瓶中，用50%DMF溶液定量稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 内标溶液 精密量取内标贮备溶液5 mL置100 mL量瓶中，用50% N,N-二甲基甲酰胺溶液定量稀释至刻度，摇匀。

2.2.4 对照品溶液 精密量取氯甲烷、氯乙烷贮备溶液3 mL置100 mL量瓶中，加内标贮备溶液5 mL，用50%DMF溶液定量稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 供试品溶液 取头孢泊肟酯原料约15 mg(以头孢泊肟计)，精密称定，置20 mL顶空瓶中，加入内标溶液1 mL，立即加盖密封，轻轻振摇溶解，摇匀，即得。

2.2.6 供试品混合溶液 取头孢泊肟酯原料约15 mg(以头孢泊肟计)，精密称定，置20 mL顶空瓶中，加入对照品溶液1 mL，立即加盖密封，轻轻振摇溶解，摇匀，即得。

2.3 专属性试验 精密量取50%DMF溶液1 mL，置20 mL顶空瓶中，立即加盖密封，作为专属性空白溶剂。取空白溶剂、定位溶液、内标溶液、供试品溶液、供试品混合溶液依次顶空进样，记录色谱图，氯甲烷、氯乙烷、氯丙烷保留时间分别为3.472、4.573、5.972 min；供试品混合溶液(见图 1)中各组分分离度良好，专属性符合可接受标准。

图1 供试品混合溶液的GC-MS图

2.4 线性关系试验 线性关系试验溶液：分别精密量取“2.2.1”项下的氯甲烷、氯乙烷贮备溶液1、2、3、4、5 mL置100 mL量瓶中，各加入5 mL“2.2.2”项下的内标贮备溶液，用50%DMF溶液定量稀释至刻度，摇匀；分别精密量取各溶液1 mL置20 mL顶空瓶中，立即加盖密封，即得线性关系试验溶液1、2、3、4、5。

取上述溶液分别顶空进样，以待测物浓度C(μg·mL-1)为横坐标，以氯甲烷峰和氯乙烷峰与内标峰峰面积的比值为纵坐标，作图，氯甲烷和氯乙烷标准曲线回归方程分别为Y=0.384 5C+0.004 865，r=0.999 1；Y=1.038C-0.001 799，r=0.999 7。该结果表明氯甲烷和氯乙烷分别在0.252 5～1.263 μg·mL-1和0.645 1～3.226 μg·mL-1范围内浓度与峰面积比值成良好的线性关系。

2.5 检测限及定量限 取氯甲烷、氯乙烷对照品适量，加50%DMF溶液溶解并稀释至所需浓度，依法测定，检测限以信噪比S/N为2～3计；定量限以信噪比S/N为10计；定量限溶液连续测定6次，检测限溶液测定1次。通过试验确定氯甲烷定量限浓度为0.040 40 ng·mL-1，检测限浓度为0.016 16 ng·mL-1；氯乙烷定量限浓度为0.103 2 ng·mL-1，检测限浓度为0.041 29 ng·mL-1。氯甲烷定量限保留时间RSD为0.04%，峰面积RSD为3.2%；氯乙烷定量限保留时间RSD为0.05%，峰面积RSD为5.2%。

2.6 准确度试验 准确度贮备溶液：分别精密量取“2.2.1”项下的氯甲烷、氯乙烷贮备溶液1、3、4.5 mL置100 mL量瓶中，各加入5 mL“2.2.2”项下的内标贮备溶液，用50%DMF溶液定量稀释至刻度，摇匀，即得准确度贮备溶液#1、#2、#3。

准确度供试品溶液：取头孢泊肟酯原料12份，每份约15 mg(以头孢泊肟计)，精密称定，置12个20 mL顶空瓶中，其中3份各加入 “2.2.3”项下的内标溶液1 mL溶解，作为空白供试品溶液，空白供试品溶液中未检出氯甲烷和氯乙烷。其余的9份样品分3组，每组各3份，分别加准确度贮备溶液#1、#2、#3 1 mL溶解，依次进样测定，用内标法计算加样回收率，氯甲烷和氯乙烷的回收率均在 80%～115%之间，符合可接受标准。结果见表1～2。

表1 氯甲烷准确度试验结果(n=9)

表2 氯乙烷准确度试验结果(n=9)

2.7 系统精密度试验 取“2.4”项下线性关系溶液3顶空进样，记录色谱图，连续测定6次，计算氯甲烷峰和氯乙烷峰与内标峰峰面积的比值的RSD，结果氯甲烷响应值RSD为0.7%，氯乙烷响应值RSD为0.6%，表明精密度良好。

2.8 重复性试验 取头孢泊肟酯原料，按照“2.2.7”项下供试品混合溶液的制备方法平行制备6份，依法测定，记录色谱图。结果氯甲烷回收率平均值为98.6%，RSD为2.4%；氯乙烷回收率平均值为100.2%，RSD为0.9%，表明重复性良好。

2.9 样品检测 取3批头孢泊肟酯原料，按“2.2.6”项下的方法制备供试品溶液，依法检测，结果均未检出氯甲烷和氯乙烷。

3 讨论与结论

3.1 顶空条件的选择 取“2.2.5”项下的定位溶液于顶空温度78、80、82 ℃，顶空时间20、25、30 min下进行顶空条件考察，结果发现氯甲烷、氯乙烷在顶空温度78、80、82 ℃，顶空时间20、25、30 min与内标溶液的峰面积比值均相差不大，故选择顶空温度80 ℃，顶空时间25 min。

3.2 限度的制定 头孢泊肟酯属于抗感染治疗用药物，其药品说明书中规定的每日最大使用剂量为0.8 g，ICH 2017年3月发布的M7(R1)指导原则《评估和控制药物中DNA反应性(突变性)杂质以限制潜在致癌风险》中氯甲烷、氯乙烷的TD50值分别为每天1 361、1 810 mg·kg-1[12],通过计算可得每日允许暴露量PDE值分别为每天1 361、1 810 μg。根据ICH Q3A(R2)中对于杂质限度的规定，我们初步将头孢泊肟酯原料药及其制剂中氯甲烷、氯乙烷的限度值定为0.1%。

药品中的很多杂质都能够产生毒副作用，尤其是基因毒性杂质，极少的暴露量就能够对人体健康产生严重的危害[12]。头孢泊肟酯原料药在《中国药典》中有收载，但未见对氯甲烷和氯乙烷的控制，本文建立的GC-MS法分析速度快、灵敏度高、定量准确，适合头孢泊肟酯原料药中氯甲烷和氯乙烷的测定，该研究为头孢泊肟酯的质量优化提供了参考依据。