基于lncRNA-mRNA网络的党参保护衰老小鼠胰腺作用机制研究

康甲超，赵盼，蒙洁，陈冬梅，王勇，段永强，田一虹，王晶

基于lncRNA-mRNA网络的党参保护衰老小鼠胰腺作用机制研究

康甲超1，赵盼1，蒙洁1，陈冬梅1，王勇1，段永强1，田一虹1，王晶1，2

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

基于lncRNA-mRNA网络探讨党参水提物对衰老小鼠胰腺的保护作用及分子机制。采用颈背部皮下注射D-半乳糖溶液制备衰老小鼠模型。将SPF级昆明种小鼠随机分为正常对照组、模型组和党参低、中、高剂量组，各给药组给予相应剂量药液灌胃，连续42 d。HE染色观察胰腺组织形态；筛选差异基因进行GO、KEGG通路分析；选取衰老后和党参干预后共同变化基因构建lncRNA-mRNA共表达网络；采用RT-qPCR验证网络中关键基因。模型组小鼠胰腺组织形态明显异常，党参低、中、高剂量组小鼠胰腺组织形态均有不同程度改善，党参高剂量组改善最明显；芯片聚类分析显示，衰老后和高剂量党参干预后lncRNAs和mRNAs发生明显变化；生物信息学分析显示，衰老后和党参干预后差异基因相同GO条目有脂肪酸代谢和线粒体，相同KEGG通路有代谢通路；对lncRNA-mRNA网络中关键基因Eci1、Dpep1、Serpini2进行RT-qPCR验证，其结果与基因芯片分析一致。lncRNA-mRNA网络在党参保护衰老小鼠胰腺中发挥重要作用。

党参；D-半乳糖；衰老小鼠；基因芯片

衰老是一种以累积退化性损伤为特征的过程，伴随多器官功能衰退，最终导致机体死亡。胰腺是机体重要的消化腺，兼有内分泌与外分泌双重功能，在维持机体糖代谢和营养物质的消化吸收等方面发挥重要作用[1]。研究表明，胰腺随着年龄增长发生衰老变化，主要表现在组织结构退变，内分泌、外分泌功能下降和各种胰腺疾病发生等方面[2-4]。党参具有调节血糖、抗缺氧、抗应激、抗疲劳、延缓衰老等药理作用[5]。课题组前期研究表明，党参可保护D-半乳糖致衰老模型小鼠肺、胸腺、肾等多器官[6-7]。迄今有关党参保护衰老小鼠胰腺组织作用机制研究尚未见报道。因此，本研究采用基因芯片技术，利用生物信息学方法分析衰老后和高剂量党参干预后的差异基因，探讨党参保护衰老小鼠胰腺的作用靶标和可能机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠100只，雌雄各半，2月龄，体质量（18±2）g，甘肃中医药大学科研实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级动物房，室温20～25 ℃，自然光照，自由摄食饮水。所有实验程序和方案均按照甘肃中医药大学动物伦理委员会指导方针执行（编号2017-106）。

1.2 药物及制备

党参采自甘肃岷县，经甘肃中医药大学中药资源教研室杜弢教授鉴定为白条党参。取党参100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，过滤，浓缩成含原药材0.5 g/mL水煎剂，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

D-半乳糖，美国Sigma公司，批号24895207，临用前用生理盐水配制成12 g/L溶液；Trizol试剂，Invitrogen公司，货号15596-026；NucleoSpin®RNA Clean-up试剂盒，MACHEREY-NAGEL公司，货号740948.250。光学显微镜，日本奥林巴斯，型号CX31；石蜡切片机，德国Leica公司，型号RM2125；安捷伦芯片扫描仪，美国安捷伦，型号G2565CA。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

将100只小鼠随机分为正常对照组、模型组和党参低、中、高剂量组，每组20只，雌雄各半。参照文献[8]方法采用颈背部皮下注射D-半乳糖溶液制备小鼠衰老模型，给药剂量为50 g/（L•d），注射量为0.025 mL/g。造模同时党参低、中、高剂量（5、10、15 g/kg）组分别给予党参药液灌胃，正常对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积0.025 mL/g，每日1次，连续42 d。

2.2 HE染色

末次给药2 h后，10%水合氯醛（0.004 mL/g）腹腔注射麻醉，颈椎脱臼法处死小鼠。取胰腺组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片（厚约3 μm）。脱蜡，HE染色，封片，镜下观察。

2.3 RNA提取、检测及数据预处理

采用Trizol提取正常对照组、模型组和党参高剂量组小鼠胰腺组织总RNA。采用NucleoSpin®RNAClean-up试剂盒对总RNA进行过柱纯化。利用Capital Bio Technology Mouse Lnc RNAArray v1，4×180K芯片，检测小鼠胰腺组织基因表达谱。用Agilent Feature Extraction（v10.7）软件分析杂交图片，并提取数据。以＜0.05、|FC|≥2为筛选标准，用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析。

2.4 生物信息学分析

为研究差异表达mRNAs生物学功能，采用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）进行差异mRNAs GO富集分析，取＜0.05的条目，包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。采用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）进行差异mRNAs KEGG通路分析，取＜0.05的前10个通路。采用Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/Venn/）取衰老后和高剂量党参干预后lncRNAs及mRNAs的交集，计算两两间Pearson相关系数（R），以|R|＞0.5、＜0.05为筛选标准，采用Cytoscape3.6.1分析软件构建lncRNA-mRNA共表达网络。

2.5 RT-qPCR检测

根据HE染色结果，采用Trizol试剂提取正常对照组、模型组和党参高剂量组总RNA，用Qubit法定量，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。采用随机引物反转录，RT-qPCR检测反转录cDNA模板。lncRNA和mRNA表达量均以GAPDH为内参基因。用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表1 各基因PCR引物序列

基因名称引物序列（5’～3’）产物长度/bp GAPDHF：GTTGTCTCCTGCGACTTCA182 R：TGGTCCAGGGTTTCTTACTC Dpep1F：AGCTCAGGGAAGACTGGACAAG 57 R：GGGTGTGGTTCTGCACGGAC Eci1F：AGGTGGGAGTGGTGGATGAG 98 R：CCGAGAATGGTCTGGGATAGC Serpini2F：CCACGGAAGACACGAGCATC 58 R：CGGACGTGAGGAGCAGTAAC

3 统计学方法

4 结果

4.1 HE染色结果

正常对照组小鼠胰腺组织结构正常，胰岛细胞结构正常，排列紧密；模型组小鼠胰岛细胞排列极为疏松，体积增大，细胞核呈椭圆形，腺泡细胞体积缩小，且大小不一，排列不规则；党参低剂量组小鼠胰岛细胞排列疏松，胞核圆形，体积增大，腺泡细胞体积缩小；党参中剂量组小鼠胰岛细胞形态正常，腺泡细胞体积较小；党参高剂量组小鼠胰岛细胞呈团状，分布规则，腺泡细胞大致正常。见图1。

4.2 胰腺组织lncRNA、mRNA差异基因筛选

以|FC|≥2、＜0.05为条件筛选差异基因，衰老后差异基因lncRNAs为332个，其中上调194个，下调138个；差异基因mRNAs为346个，其中上调272个，下调74个。高剂量党参干预后，差异基因lncRNAs为48个，其中上调22个，下调26个；差异基因mRNAs总数为209个，其中上调127个，下调82个。见图2。

4.3 差异基因功能和通路富集分析结果

对衰老后和高剂量党参干预后差异基因进行GO分析，发现相同GO条目有脂肪酸代谢和线粒体，结果见图3、图4。对衰老后和高剂量党参干预后差异基因进行KEGG分析，发现相同KEGG通路有代谢通路，结果见图5、图6。

4.4 构建lncRNA-mRNA共表达网络

根据HE染色结果，高剂量党参对衰老小鼠胰腺组织保护作用最为显著，所以本研究取衰老后和高剂量党参干预后差异基因交集，得到5个lncRNAs、34个mRNAs，见图7、图8。取交集lncRNAs和mRNAs构建lncRNA-mRNA共表达网络，包括5个lncRNAs（2个上调、3个下调）和34个mRNAs（12个上调、22个下调），共167个相互作用关系，见图9。

注：箭头所指为胰岛

注：绿色表示下调，红色表示上调

图3 衰老后差异基因GO功能分析

图4 高剂量党参干预后差异基因GO功能分析

图5 衰老后差异基因KEGG通路分析

图6 高剂量党参干预后差异基因KEGG通路分析

图7 衰老后和高剂量党参干预后lncRNAs交集

图8 衰老后和高剂量党参干预后mRNAs交集

4.5 RT-qPCR验证结果

根据lncRNA-mRNA共表达网络中节点degree＞4和芯片分析（|FC|≥2），采用RT-qPCR方法检测3个mRNAs（Eci1、Dpep1、Serpini2）。Dpep1和Eci1在衰老后胰腺组织中表达上调，高剂量党参干预后表达下

调（＜0.05，＜0.01）；Serpini2在衰老后胰腺组织中表达下调，高剂量党参干预后表达上调（＜0.05），见图10。与基因芯片分析结果一致。

注：箭头代表lncRNA，圆圈代表mRNA，橘黄色代表上调，绿色代表下调

注：与正常对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

5 讨论

衰老的胰腺组织整体发生变化，如胰腺腺泡缩小，胰岛β细胞数量减少[9]，这与本研究中胰腺组织HE染色结果一致。低、中、高剂量党参干预后衰老小鼠胰腺组织形态均有好转，高剂量党参组抗衰老效果最显著，提示党参可通过保护胰腺组织结构从而发挥抗衰老作用。研究发现，党参可明显改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗，有效改善糖尿病及相关并发症[10]。通过对衰老后和高剂量党参干预后差异基因GO富集分析，发现二者具有相同GO条目，在生物过程有脂肪酸代谢，在细胞成分有线粒体。研究表明，随着年龄增长，血浆三酰甘油代谢改变和脂肪酸分配改变是引起衰老的主要原因之一[11]。胰岛β细胞衰老不仅与年龄有关，还与肥胖和脂代谢异常使体内衰老的细胞数量增加有关[12]。线粒体是细胞的能量代谢工厂，对维持细胞的正常新陈代谢起着重要作用，其质量、活性改变与细胞衰老密切相关[13]。线粒体功能紊乱是真核生物衰老的标志[14]。胰岛β细胞衰老影响细胞功能的分子机制可能与线粒体DNA衰老机制有关[15]。通过对衰老后和高剂量党参干预后差异基因KEGG通路分析，发现二者相同的KEGG通路有代谢通路。机体的衰老必然伴随着代谢改变，党参对小鼠体内代谢的影响可能与通过影响改变内源性代谢物的能量代谢途径相关[16]。

lncRNAs可与蛋白直接相互作用，并在多个层次调节靶基因的表达或相互作用蛋白的稳定性、活性等，从而参与调节细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程[17]。Morán等[18]研究人类胰岛β细胞lncRNA的表达谱，发现1128个胰岛特异性lncRNA，且多数与胰岛分化过程有关。本研究通过lncRNA-mRNA共表达网络构建和RT-qPCR验证，证实Eci1、Dpep1和Serpini2与衰老和党参干预之间的联系。研究发现，Eci1具有分解不饱和脂肪酸的功能，衰老导致体内代谢活跃，随着年龄的增长，不饱和脂肪酸的比例逐渐下降[19-20]。衰老后Eci1基因表达上调，高剂量党参干预后表达下调，党参可能通过影响Eci1的表达起到抗衰老作用，其机制与降低不饱和脂肪酸代谢有关。Dpep1编码酶为二肽酶1，是一种锌依赖性金属蛋白酶，在谷胱甘肽代谢中起着重要作用。Dpep1可通过调节基因转录发挥肿瘤促进作用，具有促进肿瘤细胞生长、抑制肿瘤细胞凋亡和调节信号转导的生理作用[21]。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽，具有保护细胞、抗氧化、抗衰老等作用[22]。Dpep1在衰老后表达上调，高剂量党参干预后表达下调，党参可能通过影响Dpep1的表达起到抗衰老作用，其机制与影响谷胱甘肽和抑制肿瘤发生有关。Serpini2是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的46 kD成员。基因表达谱显示，Serpini2在胰腺中占主导地位。在小鼠中表达下调时与腺泡细胞凋亡和胰腺功能不全相关，Serpini2能直接抑制胰腺酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶，保护胰腺细胞免受各种酶原过早激活被水解[23]。衰老后Serpini2基因表达下调，高剂量党参干预后表达上调，党参可能通过影响Serpini2的表达起到抗衰老作用，其机制与保护胰腺组织免受各种酶原水解有关。

综上，党参可改善衰老小鼠胰腺组织形态。通过GO功能分析和KEGG通路分析发现，党参通过影响脂肪酸代谢、线粒体、代谢通路等发挥抗衰老作用。lncRNA-mRNA网络构建和RT-qPCR验证表明，Eci1、Dpep1和Serpini2与衰老及党参抗衰老相关。本研究为党参药用开发提供了一定的依据。

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Study on Mechanism of Codonopsis Radix in Protecting the Pancreas of Aging Mice Based on lncRNA-mRNA Network

KANG Jiachao1, ZHAO Pan1, MENG Jie1, CHEN Dongmei1, WANG Yong1,DUAN Yongqiang1, TIAN Yihong1, WANG Jing1,2

To explore the protective effect and molecular mechanism of Codonopsis Radix on the pancreas of D-galactose-induced aging mice based on the lncRNA-mRNA network.The aging model was prepared by subcutaneous injection of D-galactose solution on the back of the neck. SPF Kunming mice were randomly divided into normal control group, model group and low-, medium-, and high-dosage Codonopsis Radix groups. Each administration group was given the corresponding dosage of liquid medicine by gavage for 42 consecutive days. HE staining was used to observe the morphology of pancreas; differential genes were screened for GO analysis and KEGG pathway analysis; genes that change together after aging and after the intervention of Codonopsis Radix were selected to construct lncRNA-mRNA co-expression network; RT-qPCR was used to verify key genes in the network.The pancreatic tissue morphology of mice in the model group was obviously abnormal. After the intervention of low-, medium-, and high-dosage Codonopsis Radix, the tissue structure of the pancreas in each group was improved to different degrees, and the effect of high-dosage Codonopsis Radix group was the most significant. Microarray cluster analysis showed that lncRNAs and mRNAs changed significantly after aging and the intervention of high-dosage Codonopsis Radix. Bioinformatics analysis of different genes after aging and the intervention of Codonopsis Radix, the same GO entries had fatty acid metabolism and mitochondria, and the same KEGG pathway had matabolic pathways. The key genes Eci1, Dpep1, and Serpini2 in the lncRNA-mRNA network were verified by RT-qPCR, and the results were consistent with the gene chip.The lncRNA-mRNA network plays an important role in the protection of Codonopsis Radix on pancreas of aging mice

Codonopsis Radix; D-galactose; aging mice; gene chip

R285.5

A

1005-5304(2021)06-0059-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202010275

国家自然科学基金（82060829、81760835）；甘肃省高等学校科学研究一般项目（2018A-052）；甘肃省卫生行业科研计划项目（GSWSKY2017-27）

王晶，E-mail：jwang_2017@hotmail.com

（2020-10-19）

（2020-11-14；编辑：华强）