基于网络药理学探讨白藜芦醇治疗肺癌的生物分子机制

张丽慧，耿其顺，朱子家，王文斌，沈志博，李砺锋，薛文华，赵杰

基于网络药理学探讨白藜芦醇治疗肺癌的生物分子机制

张丽慧，耿其顺，朱子家，王文斌，沈志博，李砺锋，薛文华，赵杰

郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

基于网络药理学，运用在线数据库研究白藜芦醇治疗肺癌的潜在作用机制。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、PubChem、SwissTargetPrediction、GeneCards数据库分别获取白藜芦醇和肺癌的相关基因，取二者交集基因，使用String数据库获得交集基因的蛋白相互作用（PPI）网络图，使用DAVID6.8对交集基因进行GO和KEGG富集分析。采用Cytoscape3.7.2软件构建化合物-靶点-通路-疾病网络模型。使用AutoDock4.2.6软件对白藜芦醇和重要靶点进行分子对接。Western blot检测白藜芦醇对人肺癌H1975细胞p-Akt蛋白表达的影响。获得白藜芦醇和肺癌交集基因78个，PPI网络图表明交集基因关系密切。富集分析得到生物过程55项、分子功能26项、细胞组分18项，以及86条相关通路，其中以PI3K-Akt通路富集靶点较多。分子对接结果显示，白藜芦醇与PIK3CB、PIK3CA这2个重要靶点均能稳定结合。Western blot检测结果显示，白藜芦醇能够显著降低人肺癌H1975细胞p-Akt蛋白表达。白藜芦醇可能主要通过作用于PIK3CB、PIK3CA靶点，介导PI3K-Akt信号通路发挥治疗肺癌作用。

白藜芦醇；肺癌；网络药理学；作用机制；分子对接

研究表明，肿瘤的发生发展与基因突变及多条信号通路改变有关[1-2]。近年来，肺癌的发病率和病死率明显增高[3]。有资料表明，肺癌的发生与长期吸烟有密切关系[4]。肺癌也是职业癌中最重要的一种，高危职业暴露与肺癌发生有一定关系，且此类患者更易出现肺外病变，伴发呼吸系统疾病，治疗更加困难[5]。目前对肺癌主要有化学治疗、放射治疗及外科手术等手段，但预后并不满意。肺癌的发病机制复杂，通常涉及多个基因及信号通路，因此，寻找肺癌治疗的新靶点、新通路，是提高患者生活质量及改善预后的必要途径。

白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，存在于多种植物中。研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗突变、抗菌抗炎、诱导细胞凋亡等生物药理活性[6]，临床应用前景广阔。随着生物信息学的发展，通过多个生物数据库分析和整合得到药物与疾病的关系，成为药物机制研究的重要方法之一。网络药理学将药物作用网络与生物网络结合在一起，利用数据库分析药物在网络中与特定节点或模块的相互作用关系，从而理解药物和机体的相互作用[7]。本研究采用网络药理学方法探讨白藜芦醇对肺癌的潜在作用机制，为进一步研究白藜芦醇治疗肺癌的药理机制提供基础，并为临床应用提供证据。

1 资料与方法

1.1 药物与细胞

白藜芦醇（批号A506244，纯度98%），生工生物工程（上海）股份有限公司，使用前用DMSO配制成50 mmol/L母液，-20 ℃保存。H1975细胞株，中国科学院细胞库提供，用含10%胎牛血清和1%青链双抗的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5%CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，每48 h更换培养基，细胞生长铺满培养皿底80%后，用0.25%胰酶消化，加入新鲜培养基重悬，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜，取对数生长期细胞用于实验。

1.2 白藜芦醇药代动力学信息获取

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[8]获取白藜芦醇的化学结构和药代动力学相关信息，包括口服生物利用度（OB）、类药性（DL）、血脑屏障（BBB）、脂水分配系数（ALogP）、氢键受体（Hacc）、氢键供体（Hdon）、肠上皮通透性（Caco-2）等。

1.3 白藜芦醇和肺癌相关基因分析

通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）[9]获得白藜芦醇的canonical SMILES结构，将其输入SwissTargetPrediction数据库[10]预测白藜芦醇的相关基因，并根据可能性（probability）＞0进行筛选。以关键词“Lung cancer”检索GeneCards数据库（http://www.genecards.org/），获取肺癌相关基因，并根据相关性（relevance）≥3进行筛选。使用Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index.html）获取两者的交集基因。

1.4 交集基因蛋白相互作用网络构建及中心节点筛选

通过String数据库（http://string-db.org/）[11]，选用Multiple proteins工具，限定物种为人，得到交集基因的蛋白相互作用（PPI）网络，保存为TSV格式文件。将文件中的node1、node2、combined score信息导入Cytoscape3.7.2软件[12]并进行网络拓扑结构分析，以节点degree值反映基因作用大小，degree≥5的节点为网络的中心（Hub）节点。

1.5 中心节点GO和KEGG富集分析

使用DAVID6.8数据库[13]对Hub节点进行GO和KEGG富集分析，以＜0.05为条件，分析前10条生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）及重要KEGG通路。

1.6 化合物-靶点-通路-疾病网络构建

将白藜芦醇、活性靶点及相关通路信息导入Cytoscape3.7.2软件，构建化合物-靶点-通路-疾病网络。网络中节点表示白藜芦醇、靶点、通路及疾病，连线表示节点间的相互作用。用拓扑参数度数评判网络中节点的重要性，度数越大表明网络中与该节点直接相关的节点越多，该节点在网络中的重要性越高。

1.7 分子对接

将化合物-靶点-通路-疾病网络中节点度数最高的3个靶点与化合物进行分子对接。分别从ZINC（http://zinc.docking.org/）[14]和UniProt（https://www. uniprot.org/）[15]数据库获得白藜芦醇和靶点蛋白的3D结构，然后运用AutoDock4.2.6软件[16]，选择默认设置，设置Grid Box为整个蛋白分子，运行Local Search Parameters进行分子对接，以验证靶点与化合物的结合活性。

1.8 Western blot检测

将处于对数生长期的H1975细胞以2×105个/mL接种于6孔培养板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。隔夜后，加入不同浓度白藜芦醇（0、50 μmol/L），于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养48 h，弃去培养液，用PBS漂洗3次。用RIPA细胞裂解液在冰上进行裂解，提取总蛋白质，使用BCA法测定总蛋白质浓度。取15 μg蛋白质上样，8%SDS-PAGE凝胶电泳，转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相应二抗，室温慢摇孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。在条带上滴加100 μL荧光液，使用凝胶成像系统和Image J软件对各组条带进行统计分析。每孔设3个复孔。

2 结果

2.1 白藜芦醇药代动力学信息

由TCMSP获得白藜芦醇药代动力学相关信息：OB＝19.07%，DL＝0.1，BBB＝-0.1，表明该化合物不易透过血脑屏障；ALogP＝5.28，Hdon＝3，Hacc＝3，Caco-2＝0.80，表明该化合物易通过肠上皮吸收。由此可见，白藜芦醇满足一定的成药条件。

2.2 白藜芦醇和肺癌相关基因分析

以probability＞0为条件，获得白藜芦醇相关基因92个。以relevance≥3为条件，得到肺癌相关基因6596个。两者共有78个交集基因，占白藜芦醇相关基因的84.78%，表明白藜芦醇与肺癌有密切关系。交集基因PPI网络见图1。网络中节点数（number of nodes）为78，边数（number of edges）为403，平均节点度（average node degree）为10.3，平均局部聚类系数（avg. local clustering coefficient）为0.477，期望边数（expected number of edges）为143，PPI富集值（PPI enrichment p-value）＜1.0E-16，表明PPI网络中节点之间关系密切，可信度高，白藜芦醇与肺癌交集基因之间有高度关联性。

图1 白藜芦醇与肺癌交集基因PPI网络

2.3 中心节点富集分析

对PPI网络图进行拓扑结构分析，degree≥5的节点共55个，即Hub节点。对Hub节点进行GO富集分析，共获得99个富集结果（＜0.05），包括生物过程55项、分子功能26项、细胞组分18项，居前10位的GO富集结果见图2。KEGG富集分析得到86条通路（＜0.05），去除广泛通路后，富集靶点较多的主要信号通路有PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）、Rap1信号通路（Rap1 signaling pathway）等，见图3、表1。有研究表明，以上通路均与肿瘤的发生与发展密切相关[17-18]。

图2 白藜芦醇与肺癌Hub基因GO富集分析

图3 白藜芦醇与肺癌Hub基因KEGG通路富集分析

表1 白藜芦醇与肺癌Hub基因KEGG通路及相关基因

通路基因基因数目 PI3K-Akt signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PDPK1，PIK3CB，GSK3B，RELA，PIK3CA，KIT，CDK4，INSR，CDK2，SYK13 Ras signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PIK3CB，RELA，PIK3CA，PRKACA，KIT，INSR9 FoxO signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PDPK1，PIK3CB，PIK3CA，INSR，CDK28 Rap1 signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PIK3CB，PIK3CA，KIT，INSR，SRC8 HIF-1 signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PIK3CB，RELA，PIK3CA，INSR7 ErbB signaling pathwayEGFR，PIK3CG，PIK3CB，GSK3B，PIK3CA，SRC6 TNF signaling pathwayPIK3CG，PTGS2，PIK3CB，RELA，MMP9，PIK3CA6 mTOR signaling pathwayPIK3CG，PDPK1，RPS6KA3，PIK3CB，PIK3CA5 p53 signaling pathwayCDK1，CHEK1，CDK4，CDK24 NF-kappa B signaling pathwayPTGS2，RELA，LCK，SYK4

2.4 化合物-靶点-通路-疾病网络

白藜芦醇治疗肺癌的化合物-靶点-通路-疾病网络见图4。利用Network Aalyzer插件对该网络进行拓扑分析，获得节点degree值，根据degree值判断节点在网络中的重要性，结果PIK3CB、PIK3CA靶点和PI3K-Akt信号通路的degree值最高，分别为9、9、14，表明其在维持生物网络的完整性中发挥重要作用。因此，推测白藜芦醇主要通过作用于PIK3CB、PIK3CA靶点，从而介导PI3K-Akt信号通路，对肺癌产生干预作用。

2.5 分子对接结果

为进一步研究白藜芦醇与关键靶点的相互作用，将获得的白黎芦醇3D结构与PIK3CB、PIK3CA对应蛋白的3D结构导入AutoDock4.2.6软件进行分子对接，结果见图5。从结合能量最低的对接模型中发现，在GLU714氨基酸位点处PIK3CB与白藜芦醇之间形成氢键，在SER173氨基酸位点处PIK3CA与白藜芦醇之间形成氢键。分子对接结果表明，白藜芦醇与PIK3CB和PIK3CA两靶点之间存在紧密联系，白藜芦醇可以成为潜在的PIK3CB和PIK3CA作用药物。

注：蓝色代表白黎芦醇，绿色代表作用靶点，橙色代表信号通路，红色代表肺癌

图5 白藜芦醇与PIK3CB、PIK3CA分子对接示意图

2.6 Western blot检测结果

为进一步验证白藜芦醇对PI3K-Akt信号通路的作用，使用不同浓度白藜芦醇处理H1975细胞48 h，Western blot检测p-Akt蛋白表达，结果见图6。与0 μmol/L白藜芦醇比较，50 μmol/L白藜芦醇作用于细胞后，p-Akt蛋白表达显著降低。由此可进一步确认，白藜芦醇能够对肺癌细胞的PI3K-Akt信号通路产生干预作用，从而治疗肺癌。

注：与0 μmol/L白藜芦醇比较，*P＜0.05

3 讨论

白藜芦醇为低聚物，具有作为抗肿瘤药物的分子结构基础，其抗肿瘤活性已有广泛研究，但作用机制尚不明确[19]。本研究基于网络药理学，运用生物信息学数据库，发现白藜芦醇与肺癌相关的基因有78个，占白藜芦醇预测相关基因的84.78%，表明白藜芦醇对肺癌预防和治疗具有一定的作用。交集基因PPI网络平均局部聚类系数为0.477，＜1.0E-16，表明交集基因之间有密切联系，且共同作用于肺癌。通过功能富集分析和化合物-靶点-通路-疾病网络构建，发现白藜芦醇通过PIK3CB、PIK3CA、PIK3CG、EGFR、IGF1R等靶基因发挥治疗肺癌的作用。其中PIK3CB、PIK3CA存在于多条信号通路，在白藜芦醇-靶点-通路-肺癌网络中发挥着至关重要的作用。PIK3CA、PIK3CB和PIK3CG分别编码同源的p110α、p110β和p110γ同工酶，p110γ的表达主要局限于免疫细胞和白细胞，而p110α和p110β的表达普遍存在[20]。对基因工程小鼠的研究表明，这些异构体在PI3K信号的生理和致瘤性上发挥不同作用，其中PIK3CA易发生突变，诱导肿瘤形成[21]。EGFR属于酪氨酸激酶Ⅰ亚族的跨膜蛋白受体家族，与配体结合活化后可与其他成员形成二聚体结构，通过自身磷酸化启动一系列级联反应，参与细胞的信号传递，将信号传至核内，在正常细胞的增殖、分化及迁移等活动中发挥重要作用。有研究表明，EGFR在非小细胞肺癌中高度表达，并且与肿瘤的侵袭迁移能力密切相关[22]。此外，分子对接结果进一步验证了白藜芦醇能够作用于PIK3CB和PIK3CA。因此，我们推断白藜芦醇可能通过作用于这些靶基因发挥治疗肺癌的作用，这可能是白黎芦醇治疗肺癌的机制之一。

GO功能富集分析显示，基因主要富集于ATP结合、血红素结合、铁离子结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等分子功能，质膜、细胞内膜结合的细胞器、细胞质核周区域、纺锤体微管等细胞组分，以及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调控、细胞增殖和凋亡的调控、肽酪氨酸自磷酸化等生物过程，表明主要生物过程和分子功能均与肿瘤细胞的存活和增殖密切相关。KEGG通路富集分析结果显示，PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、FoxO信号通路、Rap1信号通路等是白藜芦醇发挥抗肺癌作用的重要信号通路，其中PI3K-Akt信号通路富集的相关基因最多。研究表明，PI3K-Akt途径与细胞增殖、细胞凋亡、癌细胞增殖和侵袭能力有紧密联系，是人类癌症中最常见的突变网络之一，其作用是切断外源性生长刺激对细胞生长、生存和代谢的控制，在癌症代谢及致癌信号中均发挥着重要作用，该途径的异常激活与肿瘤发生、癌症进展和药物有关抵抗性均密切相关[23]。此外，孙龙和等[24]通过体外细胞实验表明，白藜芦醇可通过影响PI3K/Akt信号通路抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移。本研究分子生物学实验结果表明，白藜芦醇能够对肺癌细胞的PI3K-Akt信号通路产生干预作用。由此可以推测，PI3K-Akt信号通路是白藜芦醇治疗肺癌的重要信号通路之一。

已有研究表明白藜芦醇对肺癌有一定治疗作用[25]，但其作用靶点及相关信号通路尚不明确。本研究基于网络药理学研究方法和分子对接技术分析白藜芦醇治疗肺癌主要相关基因，构建靶标蛋白相互作用网络，通过对白藜芦醇治疗肺癌的靶点基因进行GO和KEGG通路富集分析，阐述了白藜芦醇主要通过作用于PIK3CB、PIK3CA靶点，介导PI3K-Akt信号通路发挥抗肺癌的作用机制，可为后续白藜芦醇治疗肺癌的机制研究及临床应用提供依据。

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Biomolecular Mechanism of Resveratrol Against Lung Cancer Based on Network Pharmacology

ZHANG Lihui, GENG Qishun, ZHU Zijia, WANG Wenbin, SHEN Zhibo, LI Lifeng, XUE Wenhua, ZHAO Jie

Touse the online databases to study the potential mechanism of resveratrol in treating lung cancer based on network pharmacology.The genes related to resveratrol and lung cancer were obtained from TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction and GeneCards database, and the related intersection genes of resveratrol and lung cancer were screened out. The String database was used to draw the PPI network diagram of the intersection genes, and the DAVID 6.8 was used to perform GO and KEGG enrichment analysis. The compound-target-signal pathway-disease network model was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software. AutoDock 4.2.6 software was used to perform molecular docking of resveratrol and important targets. Western blot was used to detect the effect of resveratrol on the expression of p-Akt protein in human lung cancer H1975 cell line.Totally 78 intersection genes of resveratrol and lung cancer were obtained, and the PPI network diagram showed that there was a close relationship between them. The enrichment analysis mainly obtained 55 biological processes, 26 molecular functions, 18 cellular components, and 86 related pathways, among which the PI3K-Akt pathway enriched the most targets. Molecular docking results showed that resveratrol could stably bind to two important targets, PIK3CB and PIK3CA. Western blot test results showed that resveratrol could significantly reduce the expression of p-Akt protein in human lung cancer H1975 cells.Resveratrol may mainly act on the targets of PIK3CB and PIK3CA, and mediates the PI3K-Akt signaling pathway to exert anti-lung cancer action.

resveratrol; lung cancer; network pharmacology; action mechanism; molecular docking

R273.42；R285

A

1005-5304(2021)06-0046-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004113

国家重点研发计划（2017YFC0909900）

赵杰，E-mail：jiezhaoz2016@163.com

（2020-04-03）

（2020-04-23；编辑：陈静）