采前水杨酸处理对芒果保鲜效果及其相关机理研究*

弓德强，胡美姣，高兆银，李 敏，陈千付，黄慧俐，杨谨瑛，黄台明，朱世江

（1 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南海口571101）（2 华南农业大学园艺学院）（3 广西百色市现代农业技术研究推广中心）（4 海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室）

芒果（Mangifera indicaL.）是我国广西、海南、四川和云南等热区农业的支柱产业，但芒果是一种不耐贮运的热带水果。由于芒果果实在采前田间易受病原菌潜伏侵染，而且采后极易后熟软化，导致芒果在采后贮运中发病而腐烂[1]。目前，生产上常用化学杀菌剂浸泡处理防治芒果采后病害，但增加了劳动力成本和采后损耗，同时也不利于食品安全[2]。近年来，采后病害的防控和保鲜越来越侧重于从采前措施入手，其中采前利用抗病性诱导技术防控芒果采后病害已经成为研究热点之一。

研究表明，水杨酸（salicylic acid，SA）作为一种诱导植物抗病性的天然诱抗剂，于采前处理可提高樱桃[3]、梨[4]、脐橙[5]、枣[6]和杏[7]等果实对采后病害的抗性，并有效保持果实的品质，从而达到较好的防腐保鲜效果。采前水杨酸处理控制芒果采后病害也有一些研究报道。曾凯芳和姜微波[8]研究表明，采前应用较低浓度（0.1 mmol/L）的水杨酸处理不仅能延缓‘紫花’芒果采后衰老进程，而且能有效控制芒果采后病害的发生。Sanikommu 等[9]研究发现，采前喷施200 mg/L 水杨酸可抑制采后芒果乙烯的产生，从而延缓果实后熟衰老，并维持较高的果实品质。弓德强等[10]系统研究了采前水杨酸处理对‘红芒6 号’芒果采后品质和抗病性的影响，筛选了采前水杨酸处理适宜的浓度、时期和次数，并进一步研究发现，采前水杨酸处理提高采后芒果果实品质和抗病性与抗氧化酶活性的增强、膜脂过氧化程度的降低及后熟衰老进程的推迟密切相关。

近年来对采前水杨酸处理提高芒果采后抗病性与品质机理的研究越来越多，但仍然不够深入。本研究以‘红芒6 号’芒果为材料，研究采前水杨酸处理对采后芒果果实品质和抗病性的影响，并探讨其与乙烯合成、果实软化及防御酶相关基因表达的关系，以期为改进和完善水杨酸应用于芒果防腐保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2019 年在广西百色市田阳区百育镇芒果生产园进行。供试芒果品种为‘红芒6 号’，选择生长良好、树势健壮、树龄约15 年的芒果树为试验树。

水杨酸为分析纯（99.9%），购自Sigma 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 采前处理

处理时间为2019 年6 月3 日（即谢花后约60 d），此时果实发育已接近正常果大小。水杨酸处理浓度为40 mg/L，以清水为对照，均匀喷施于芒果果面后套上黑色纸质果袋。处理与对照各重复3次，每次重复3 株树。

1.2.2 采收与选果

于2019 年7 月28 日采收，芒果成熟度为七八成熟，此时果实中可溶性固形物含量为6.5%左右。挑选出大小、颜色基本均匀，无机械损伤，无明显病斑或虫咬的果实作为后续试验用果。

1.2.3 接种炭疽菌与病斑直径测定

采前水杨酸处理和对照各30 个果，分别接种芒果炭疽菌，接种炭疽菌参照弓德强等[11]的方法，并用直尺测量接种后8 d 和10 d 时果实的病斑直径，以10 个测定数值取平均值表示病斑直径，每处理重复3 次。

1.2.4 常温贮藏

采前水杨酸处理和对照各120 个果，装入带孔的硬纸箱中，每个果箱装入20 个果，放在温度为22～25 ℃、空气相对湿度为80%～90%的常温库中贮藏。定期调查自然发病的病情指数，测定乙烯释放速率，并取样测定果实硬度、内在品质及相关基因的表达情况。

1.2.5 自然发病的病情指数调查

在常温条件贮藏的芒果中，采前水杨酸处理和对照各固定3 箱共60 个芒果，参照弓德强等[12]的方法调查每箱芒果常温贮藏8 d 和10 d 时的病情指数，每处理重复3 次。

1.2.6 乙烯释放速率的测定

采用封罐法测定第0、2、4、6、8、10、12 d时芒果乙烯释放速率。在常温条件贮藏的芒果中，处理和对照各固定5 个芒果放入4.5 L 的密封塑料盒中，放置在常温条件下3 h，然后用1 mL 的注射器从盒内吸取1 mL 气体，通过Agilent（美国）5795型气相色谱仪测定，每处理重复测定3 次。

1.2.7 果实硬度的测定

在常温条件贮藏的芒果中，于第0、2、4、6、8、10 d 各取样1 次，每次取5 个果实。果实硬度采用GY-B 型硬度计进行测定，取10 次数据平均值表示；将果肉和果皮分别切成小块并混匀后用液氮速冻处理，并放于-80 ℃冰箱中保存，分别用于其他品质指标测定和相关基因的表达。

1.2.8 果实品质指标的测定

参照梁清志等[13]的方法。维生素C 含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定；可溶性固形物含量采用手持折光仪测定；可滴定酸含量采用酸碱中和滴定法测定，按柠檬酸的含量计算可滴定酸含量；用可溶性固形物和可滴定酸含量的相对比值表示固酸比。

1.2.9 目的基因相对表达量分析

参考Hong 等[14]的方法，用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析目的基因MiACO、MiEG、MiGLU和MiCHI的相对表达量，以ACTIN作为内参基因。4 个目的基因和1 个内参基因的引物序列信息见表1。将对照芒果0 d 取样时间点的基因表达量设为1，计算各处理不同取样时间点样品的基因相对表达量。

表1 用于基因表达分析的引物序列

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2003 软件和DPS 数据统计系统对试验数据进行处理和统计分析，利用LSD 法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 采前水杨酸处理对采后芒果病斑直径和病情指数的影响

由图1 可知，在贮藏8 d 和10 d 时，采前水杨酸处理芒果自然发病的病情指数均显著低于对照，防治效果分别为80.95%和68.49%；采前水杨酸处理芒果接种炭疽菌后8 d 和10 d 时的病斑直径均显著低于对照，分别比对照降低了36.67%和23.17%。结果表明，采前水杨酸处理能够提高采后芒果果实对炭疽菌侵染的抗性，对芒果具有良好的防腐保鲜效果。

图1 采前水杨酸处理对采后芒果贮藏期间的病情指数和病斑直径的影响

2.2 采前水杨酸处理对采后芒果乙烯释放速率的影响

由图2 可知，采前水杨酸处理芒果在贮藏期间乙烯释放速率的变化趋势与对照相似，呈先升高后降低的变化趋势，采前水杨酸处理降低了采后芒果乙烯释放速率的峰值，并使乙烯峰值的到来推迟了4 d，其中贮藏前期（0～8 d）的乙烯释放速率显著低于对照。结果表明，采前水杨酸处理能够抑制芒果内源乙烯的产生。

图2 采前水杨酸处理对采后芒果贮藏期间乙烯释放速率的影响

2.3 采前水杨酸处理对采后芒果果实硬度的影响

由图3 可知，采后芒果在常温贮藏中果实硬度逐渐降低，采前水杨酸处理延缓了采后芒果果实硬度的降低，其中贮藏期2～10 d 果实硬度显著高于对照。

图3 采前水杨酸处理对采后芒果贮藏期间果实硬度的影响

2.4 采前水杨酸处理对采后芒果品质指标的影响

由图4 可知，在采后贮藏过程中，采前水杨酸处理和对照果实维生素C、可溶性固形物和可滴定酸含量的变化趋势相似，即先升高后降低。其中采前水杨酸处理和对照果实维生素C 含量均在贮藏6 d 时达到最大值，并在贮藏4～10 d，采前水杨酸处理果实维生素C 含量显著高于对照；采前水杨酸处理和对照果实可溶性固形物含量分别在贮藏8 d 和6 d 时达到最大值，并且贮藏前期（2～6 d）采前水杨酸处理低于对照，贮藏后期（8～10 d）高于对照，差异基本达到显著水平；采前水杨酸处理和对照果实可滴定酸含量分别在贮藏6 d 和4 d 时达到最大值，并且整个贮藏期采前水杨酸处理均显著高于对照；对照果实固酸比在贮藏前期（0～4 d）变化平缓，6 d 后急剧升高，而采前水杨酸处理果实固酸比在贮藏前期（0～6 d）变化平缓，8 d 后略有升高，并且在整个贮藏期均显著低于对照。

图4 采前水杨酸处理对采后芒果贮藏期间品质指标的影响

2.5 采前水杨酸处理对采后芒果MiACO 和MiEG表达量的影响

由图5 可知，在贮藏前期（0～4 d），对照果 实MiACO的表达变化较缓，6 d 后开始迅速升高，8 d 时达到峰值，然后降低；而采前水杨酸处理芒果MiACO的表达变化一直较为平缓，并且在贮藏中后期（4～10 d）显著低于对照。表明采前水杨酸处理抑制了采后芒果MiACO的基因表达。

在贮藏前期（0～4 d），对照果实MiEG的表达变化较缓，6 d 后开始迅速升高，10 d 时达到最大值；而采前水杨酸处理抑制了采后芒果MiEG的表达，整个贮藏期间一直处于较低水平，其中贮藏后期（6～10 d）显著低于对照（图5）。

图5 采前水杨酸处理对采后芒果贮藏期间MiACO 和MiEG 表达量的影响

2.6 采前水杨酸处理对采后芒果MiGLU 和MiCHI表达量的影响

由图6 可知，采后芒果在贮藏过程中MiGLU和MiCHI表达变化趋势基本一致，均在贮藏6 d 时表达上调，达到峰值，然后降低；而采前水杨酸处理提高了MiGLU和MiCHI的表达，均在贮藏4 d时表达上调，6 d 时达到最大值，然后逐渐降低，其中贮藏期4～10 d 均显著高于对照。

图6 采前水杨酸处理对采后芒果贮藏期间MiGLU 和MiCHI 表达量的影响

3 讨论与结论

本试验结果表明，采前喷施40 mg/L 水杨酸处理能够显著抑制采后芒果果实硬度的降低和维生素C 的降解，延缓可溶性固形物含量的升高过程，保持较高的可滴定酸含量，从而抑制固酸比的升高，表明采前水杨酸处理能够推迟采后芒果果实的后熟衰老进程，从而延缓果实品质的下降，达到防腐保鲜的目的。这与前期的研究结果基本一致[10,14]，在桃[15]、甜瓜[16]、枣[17]和葡萄[18]等果实上也有类似的研究结果。关于采前水杨酸处理延缓果实采后成熟衰老及保持果实品质的相关机理，已经有大量的研究报道。张帆等[19]研究发现，采前水杨酸处理主要通过诱导次生代谢物质产生和增强清除DPPH 自由基能力来提高树莓果实采后保鲜效果。敬媛媛等[16]研究表明，采前水杨酸处理可通过抑制纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶等酶的活性有效延缓甜瓜果实硬度的下降，从而延缓果实的后熟软化进程。Sanikommu 等[9]研究结果表明，采前水杨酸处理能通过抑制芒果内源乙烯的产生进而延缓芒果后熟衰老进程，从而保持较高品质，延长保鲜期。这与本试验的研究结果相似。ACC 氧化酶（ACO）是乙烯生物合成中的两个关键酶之一，主要催化由1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）到乙烯（C2H4）的转化过程[20]。在本试验中，采前水杨酸处理显著抑制了芒果ACC 氧化酶基因（MiACO）的表达，降低了果实乙烯释放速率的峰值，并推迟乙烯峰值到来时间达4 d，表明采前水杨酸处理可通过抑制MiACO的表达进而抑制内源乙烯的产生。果实软化是芒果成熟的重要标志之一，内切-1,4-β-葡聚糖酶（EG）作为一种纤维素酶，在果实后熟软化中起着重要的作用[21]。EG 是一类由多基因家族编码的细胞壁代谢酶之一，EG 基因的表达与内源乙烯关系密切，与果实早期成熟软化的启动有关[22]。在本研究中，采前水杨酸处理显著抑制了采后芒果贮藏过程中MiEG表达水平的升高及果实硬度的降低，从而延缓了果实的后熟软化，保持了较高的内在品质。可见，MiEG在芒果果实后熟软化中起着重要的正调控作用。

水杨酸是植物抗病性的重要诱导因子，是植物体内自身合成的一种类似植物激素的酚类化合物，能诱导多种植物对病毒、真菌及细菌病害产生抗性[23]。本研究结果显示，采前水杨酸处理可显著抑制采后接种芒果炭疽病菌的果实病斑的扩展，并且显著降低芒果在自然贮藏条件下的病情指数。该结果与我们前期的研究结果是基本一致的[10]，表明采前水杨酸处理能够诱导采后芒果果实产生抗病性，从而减轻采后果实发病的严重程度。采前水杨酸处理提高采后果实的抗病性与其能诱导一系列抗性相关的防御酶活性及其相关基因表达水平的提高密切相关，其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、几丁质酶（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）是几种重要的防御酶，相关研究报道较多。Qin 等[24]在樱桃果实上喷施水杨酸，诱导了果实PAL、PPO 以及GLU 活性的增强。Yao 和Tian[3]研究发现，水杨酸采前喷施和采后浸泡都能显著增强樱桃果实中PAL、POD 和GLU 的活性，从而提高采后果实的抗病性。Cao 等[4]研究表明，采前水杨酸处理提高‘鸭梨’果实抗病性与诱导PAL、CHI 和GLU 等酶活性的增强有关。水杨酸作为植物抗病反应的信号分子，能诱导植物产生抗病性，促使多种病程相关蛋白（PRs）的表达[25]。其中GLU 和CHI 是研究比较多的2 个重要的PRs，分别属于PR-2 和PR-3 家族[26]。Xu 等[27]研究表明，外源水杨酸处理桃果实能够诱导CHI 和GLU 基因表达的增强，从而提高果实的抗病性。在本试验中，采前水杨酸处理显著增强了采后芒果MiCHI和MiGLU的表达水平，激发果实内在的防御反应机制，从而增强果实的抗病性，延缓采后病害的发生。

总之，采前水杨酸处理能够提高采后芒果果实的品质和抗病性，在生产上具有广阔的应用前景。并且，采前水杨酸处理提高采后芒果品质和抗病性与芒果乙烯合成、软化相关基因表达的抑制和防御相关基因表达的增强密切相关。