铁还原菌Shewanella xiamenensis BC01的有机溶剂应激研究

陈婷婷，韩恺忻，陈翠雪，凌雪萍，沈亮，卢英华

（厦门大学化学化工学院，福建厦门361005）

引 言

希瓦氏菌（Shewanellasp.）是一种革兰阴性、兼性厌氧菌，形态多为长约2µm 的棒状，广泛分布于海洋等水生环境，部分种属可在严苛的环境下生存[1-2]。希瓦氏菌具有多样化的代谢能力，由于其细胞内广泛存在细胞色素c，因此可利用溶液中的不溶性固体特别是Fe（Ⅲ）等胞外不溶性矿物氧化物[3-6]作为电子终端受体，所以希瓦氏菌也以铁还原菌著称。

近年来希瓦氏菌被广泛应用于环境修复方面的研究，包括染料褪色[7-9]、重金属还原[10-11]、硝基苯去除[12]等，相比传统的手段，利用微生物治理环境可以有效减少有害物质的产生，且过程更加温和、操作更加简便。此外，随着微生物燃料电池（MFCs）的兴起，作为典型的胞外电子传递微生物，希瓦氏菌在MFCs中表现出不凡的产电能力[13-15]。

希瓦氏菌在去除染料、重金属及其他污染物时，难免会接触到各类有机溶剂，低浓度的有机溶剂便可对细胞产生不利影响，会破坏细菌细胞结构及功能的完整性[16]。一般有机溶剂对细胞的毒性具体表现在两个方面[17]：一是改变细胞膜结构及功能，影响细胞膜生理过程中的能量产生和物质转运，产生生长抑制，有时甚至导致细胞死亡；二是将细胞的新陈代谢途径破坏，直接导致细胞死亡，因此考察微生物对于有机溶剂的耐受性可以为其在实际应用中发挥更优越的性能提供理论依据。

与其他环境应激抑制类似，在有机溶剂的胁迫下，许多微生物通过改变细胞膜结构、增加饱和脂肪酸比例、改变外膜生理形态、降解胞内溶剂等行为来适应外界的有机溶剂的刺激。已报道的耐有机溶剂微生物多为革兰阴性菌，其中很大一部分属于假单胞菌属[18-19]，近年来也有不少耐有机溶剂革兰 阳 性 菌 的 报 道，如Bacillus[20]、Staphylococcus[21]、Rhodococcus[22]和Arthrobacter[23]等菌属。

目前关于希瓦氏菌和有机溶剂的相互作用研究多着重于乳酸、二甲基亚砜（DMSO）等可作为希瓦氏菌电子受体的溶剂，对于其他溶剂的应激研究较少。因此，本研究主要探讨了厦门希瓦氏菌Shewanella xiamenensisBC01（SXM）在不同有机溶剂应激下的形态、生长速率、形态及蛋白表达变化，并通过酶活测定探究应激下SXM 的形态变化，以及通过定量PCR方法探讨了基因水平上的变化。

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 实验所用菌种为新型海洋产电菌株Shewanella xiamenensisBC01，筛选自厦门大学白城海域，简称SXM，为棒状形态的革兰阴性菌，菌落呈红棕色，兼性厌氧。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨、酵母粉（BR，OXOID LTD.）；琼脂粉、甘氨酸（BR，鹭隆生物有限公司（分装））；无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、叔丁醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、考马斯亮蓝R-250、EDTA、过硫酸铵（AR，国药集团化学试剂有限公司）；琼脂糖（BR，法国BIOWEST 公司）；Tris Base（BR，NOVON）；SDS（BR，Sigma-Aldrich 公司）；TEMED（BR，生工生物工程有限公司）；30%丙烯酰胺溶液（BR，美国BIO-RAD 公司）；25% 戊二醛（AR，Acros Organics 公司）；蛋白质上样缓冲液（索来宝公司）；蛋白质电泳Marker（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.1.3 主要仪器 SpectraMax MS190 酶标仪（Molecular Devices 公司）；FD-1000 型冷冻干燥机（上海爱朗仪器有限公司）；MJ Mini PCR 仪、电泳仪（Bio-Rad 公司）；GEL LOGIC 200 凝胶成像系统（柯达公司）；Zeiss Sigma 扫描电镜（德国Zeiss 公司）；Step one Plus 定量PCR 仪（ABI）；NanoZS90 Zetasizer（马尔文仪器有限公司）；TU88 扫描仪（GE 公司）；85-AC/EXP厌氧工作站（PLAS LABS公司）。

1.1.4 培养基 Luria-Bertani（LB）液体培养基（g/L）: NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母粉5，使用1 mol/L NaOH调节pH至7.0；LB 琼脂固体培养基（g/L）: NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母粉5，琼脂粉15，使用1 mol/L NaOH 调节pH至7.0。

1.2 方法

1.2.1 扫描电镜测试 将一小滴洗涤过的SXM 菌液置于硅片上，添加浓度为2.5%的戊二醛将样品固定2 h，然后使用乙醇和叔丁醇脱水，最后在15 kV工作电压下进行扫描。

1.2.2 菌体平均粒径大小的测定 取1～2 ml 培养好的菌液，调节OD600=0.5，用纯净水洗涤2～3次，洗去剩余培养基。将菌体沉淀重悬于1 ml 纯净水中，加入样品池后，进行平均粒径的测定。

1.2.3 SDS-PAGE 蛋白电泳 用蛋白质染料在100℃下处理OD600值约为2 的全细胞样品（时长5 min），然后通过SDS-PAGE 电泳，分别用10%和4%的聚丙烯酰胺对凝胶进行分离和浓缩，利用pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲液作为电极缓冲液。Bio-Rad微型凝胶电泳装置中，在室温下每片20 mA 的恒流条件下，从阴极到阳极进行电泳，并用考马斯蓝R-250染色显示蛋白。使用Labscan 6.0 图像扫描仪扫描染色的凝胶,随后利用Quantity One 软件（Bio-Rad）分析，最后用牛血清白蛋白标准曲线计算标记物的蛋白含量。

1.2.4 铁还原酶测定 收集不同应激条件下培养24 h 的菌液，调节OD600值约为2，将按9∶4 比例混合的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）与FeCl3溶液或柠檬酸铁溶液用高纯氮进行除氧处理。酶活测定体系设置：PBS 与FeCl3或柠檬酸铁混合液195 µl，40 mmol/L Ferrozine（铁酸盐）15µl，40 mmol/L 甲酸钠60µl，酶液30 µl，加入小试管中混匀后，于厌氧、室温下静置。从静置起计时，于一定时间间隔取样（样品需先在14000 r/min，5 min条件下离心后取上清液），测其562 nm 波长下的吸光值，根据各时间点吸光值的变化，取线性变化范围（线性增加）计算酶活。Fe(Ⅱ)-Ferrozine 络合物的摩尔消光系数ε= 29000 L/(mol·cm)。

酶活计算公式为：

1.2.5 定量PCR 测定 以SXM 基因组为模板，对需要进行定量PCR 验证的基因进行全长PCR，之后进行PCR 产物回收，采用凝胶纯化试剂盒（Omega DNA）对PCR 产物进行直接回收。由于目的基因需用于定量PCR 实验，根据下式计算拷贝数后，逐级稀释至所需浓度并保存，拷贝数计算公式为：

将待测样品进行RNA 提取（Bio-Rad 试剂盒）后，采用反转录试剂盒（ABI）进行反转录得到cDNA，将cDNA 及目的基因标准品同时进行定量PCR 实验（Bio-Rad 试剂盒），并依据CT值及标准曲线计算样品中目的基因的拷贝数。

2 实验结果与讨论

2.1 有机溶剂对SXM生长的影响

有机溶剂对细菌的主要作用部位为细胞膜。细菌的细胞质膜是磷脂双分子层，其中嵌入了多种维持细胞能量状态、调节细胞内环境、负责信号转导和能量转导的酶和转运蛋白，而溶剂会进入并破坏双分子层，从而损害细胞活力[24]。有机溶剂本身的性质（与水的亲和程度及结构等）则会对微生物细胞产生不同的影响。

为探究不同浓度有机溶剂对SXM 生长的影响，选取了八种有机溶剂及三种浓度进行生长曲线测试，具体结果如图1 所示。实验中选取的七种有机溶剂的性质和不同应激条件下测得的比生长速率列于表1中，其中lgP值指溶剂在等摩尔辛醇和水中的分配系数的对数值，即表示溶剂的疏水性，lgP值越小极性越大；反之，lgP值越大则极性越小。有研究表明，有机溶剂对细胞的危害与lgP值息息相关,且lgP值范围在1～4 时对细菌毒性较大，这是因为lgP低于1 的溶剂通常亲水性太强而无法进入细胞膜，而lgP高于4的溶剂疏水性太强而无法具有高水溶性，加之其不可生物利用性，故不会引起毒性作用[16,25-26]。

根据生长曲线结果，实验所选取的有机溶剂对于SXM 的毒害作用顺序为：正丁醇>叔丁醇>正丙醇>异丙醇>丙酮>DMSO>乙醇>甲醇，这一顺序与溶剂lgP值顺序一致，即在一定范围内溶剂的lgP值越大，对希瓦氏菌的毒害作用越大。本研究对lgP小于1 的几种溶剂进行了测试，证实了在lgP值小于1的条件下，溶剂的疏水性也与其生物毒害性存在关联。

本实验中，当外加溶剂为亲水性较差的丁醇时，其对SXM 的生长抑制作用明显，而丁醇的同分异构体叔丁醇，由于其相较正丁醇亲水性更好，所以对SXM 的生长影响也更小，SXM 的耐受程度仍可达2%。当外加溶剂为亲水性较好的低级醇类、丙酮及DMSO 时，SXM 的耐受程度普遍较好。尤其对甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇这四类亲水性醇类有机溶剂，在外加溶剂浓度为2%时仍可正常生长，对甲醇的耐受程度甚至可以达到5%。在相同浓度下，SXM 对四种溶剂的耐受程度为甲醇>乙醇>异丙醇>丙醇，故在结构稳定的低级醇类中，溶剂对SXM 生长造成的影响也可根据其亲水性（即lgP值）作为初步判断，亲水性越高，对SXM的生长影响越小。

图1 SXM在不同溶剂应激下的生长情况Fig.1 Growth curves of SXM in culture with different solvents at 30℃and 150 r/min in LB medium

作为实验室常见的有机溶剂，丙酮在大气化学中有一定的影响作用，故考察了丙酮对SXM 的生长影响情况。在低浓度（1%和2%）情况下，SXM 对丙酮的耐受程度较好，当浓度为5%时，虽然SXM 能在此条件下存活，但生长速率相较原始条件明显降低，生长初期延滞效应显著，直到培养时长超过12 h后才有较快生长。部分关于丙酮的文献研究[27]表明，少数希瓦氏菌具有利用丙酮作为碳源或是生产丙酮的能力，但产量很低，仅为150 µmol/OD600，而5%的丙酮浓度远大于其生产能力，因此只有在丙酮浓度较低时，SXM才能恢复生长。

DMSO 是希瓦氏菌的电子受体之一，也可作为细胞低温保存时的保护剂。DMSO 在低浓度（1%和2%）情况下对SXM 的生长影响较小，SXM 的生长与原始状态差异不大，当浓度为5%时，其OD600值仍可达到原始条件的60%以上，说明SXM 对DMSO 的耐受性较好。此外，在测定生长曲线的过程中，发现DMSO 被还原，并生成具有刺激性气味的DMS，说明DMSO 被SXM 所利用。根据文献[28]，希瓦氏菌MR-1对DMSO 的利用机制与对金属异化还原的机制类似，二者均为细胞外进行的还原行为，因此推测细胞将DMSO 定义为不可溶的固体受体，选择在胞外进行代谢。

2.2 有机溶剂对SXM细胞形态的影响

研究表明，有机溶剂对细胞的影响主要有渗透入细胞内作用和在细胞膜表面发生作用两个方面，为了探究对SXM 生长毒害作用较小的溶剂是否对其生物细胞膜有影响，采用SEM 分析SXM 细胞表面，结果如图2 所示。同时测量了不同溶剂应激后SXM 的粒径变化，结果列于表2，表中的PDI 数值表示溶液的分散性，值越大表明分散性越差。

根据SEM 图像，原始的SXM 呈椭圆杆状，在细胞之间有明显的纳米尺度的类菌毛丝状。外加溶剂中，乙醇、丙酮和DMSO 对SXM 的形态没有较大影响，丙醇和丁醇对SXM 的形态改变最为明显。在丙醇应激情况下，SXM 细胞发生明显形变，呈细长的条状，最长可达10µm 以上。但丙醇对SXM 的生长速率影响较小，故认为丙醇与细胞膜发生作用并破坏了细胞膜的正常功能与形态，从而影响了细胞的分裂过程，导致其被拉长。在丁醇应激情况下，细胞不仅形态上由杆状变为类似球状，且大小也从2 µm 缩减至1 µm 左右，鉴于丁醇亲水性较差，对SXM 的毒害作用也更为明显，因此推测SXM 通过改变大小来应对丁醇的刺激。

由表2中数据可知，SXM 在丙醇应激下，粒径明显增大，且PDI 值显著增加，说明溶液分散性变差；在丁醇应激下，粒径明显变小；其余外加溶剂的介入没有对粒径大小产生较大影响，均与SEM 图像呈现结果一致。

表1 有机溶剂的性质与SXM在不同溶剂培养下的比生长速率Table 1 Physical properties of different organic solvents and specific growth rate for SXM cultured in different solvents

表2 有机溶剂应激下SXM的粒径变化Table 2 Particle size distribution of SXM under cultured in different organic solvents

值得注意的是，将丙醇和丁醇应激条件下的SXM 培养12 h 后，重新接入新鲜的LB 培养基培养12 h后，SXM可恢复到原貌，可认为在本研究的实验条件下，丙醇和丁醇对SXM 造成的影响是可逆的，也可说明SXM 具有在不同环境下通过调控蛋白分泌等行为以适应环境的能力。

2.3 有机溶剂对SXM蛋白形态与分布的影响

为探究有机溶剂对SXM 影响的具体机制，对其在各有机溶剂应激下的全细胞和亚细胞的蛋白电泳进行分析，电泳结果如图3所示，其中红色箭头指示的条带为醇类应激后表达量明显下调的蛋白，蓝色箭头指示的条带为丙酮和丁醇应激后表达量明显上调的蛋白，黄色箭头指示的条带为丙醇和丁醇应激后该区域逐渐变得不完整的蛋白，可以看到丙醇和丁醇应激下的蛋白形态与表达都有了明显的变化。根据SDS-PAGE 结果，选取差异蛋白进行MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定，表3 为差异蛋白的质谱鉴定结果，经过质谱鉴定、MASCOT数据库匹配后得到的蛋白均具有较高的分数，这一分数代表鉴定结果的可靠性，分数越高则结果越可信。本次鉴定结果的分数均在300 以上，部分结果更能达到1000 以上，说明质谱鉴定得到的结果可信度极高。

根据图3 和表3，TonB 受体、IucA/IucC 家族蛋白、磷酸葡糖酶亚基及含铁乙醇脱氢酶四种蛋白在丙醇与丁醇应激下，表达量都表现出下调，而热激蛋白90（Hsp90）与芳香烃降解膜蛋白表达量则上调；此外，丙醇与丁醇应激使得外膜蛋白OmpA 以及孔蛋白porin 的蛋白电泳形态被破坏，变得较不完整。Hsp90 作为普通应激机制中常出现的蛋白，在丙醇与丁醇应激之下表达量上调，证明SXM 对于这两种醇类的胁迫作出了应激响应，结合前文所述的应激机制与SEM 观测到的结果，说明丙醇应激下细胞被拉长以及丁醇应激下细胞缩小都是SXM 的一种应激机制。

TonB 受体、IucA/IucC 家族蛋白及含铁乙醇脱氢酶三个蛋白都直接或间接参与了希瓦氏菌的铁相关代谢途径，而醇类应激之后这些蛋白的表达量有所下降，因此推测醇类应激之后，SXM 对于铁的吸收、还原能力会受到一定抑制，为印证这一点，对不同溶剂下的SXM 铁还原酶活力进行了测试，铁还原酶是一类能还原非蛋白铁复合体的酶，可利用NAD(P)H 作为电子供体将Fe3+复合体还原为Fe2+复合体，还原态的Fe2+随后被含铁蛋白所利用。如表4所示，SXM 的铁还原酶活性在丙醇及丁醇应激下均大幅下降，这一结果与SDS-PAGE结果相符。

2.4 有机溶剂对SXM基因表达的影响

图2 不同有机溶剂应激下SXM的扫描电镜表征Fig.2 The SEM result of SXM bearing different solvents

图3 不同应激条件下SXM的蛋白电泳分析（Ori：原始条件,P1、P2分别表示1%丙醇与2%丙醇,B1表示1%丁醇；箭头所示蛋白均经MALDI-TOF-TOF进行后续分析）Fig.3 SDS-PAGE profiles of SXM cultured at normal condition(Ori),1%n-propanol(P1),2%n-propanol(P2)and 1%n-butanol(B1)for whole cell and periplasm,respectively(The proteins indicated by the arrows were followed by MALDI-TOF-TOF)

一般微生物在有机溶剂的应激下，会改变基因表达以适应新的环境，例如大肠杆菌通过应力响应基因marA、robA和soxS的过表达以提高有机溶剂的耐受水平[22,29]。周质（MtrA）、外膜（MtrB 和MtrC）和内膜（CymA）c 型细胞色素的存在使希瓦氏菌能够进行胞外电子传递，因此MTR 代谢路径在希瓦氏菌进行金属异化还原过程中起着关键作用[30]。蛋白电泳结果表明，在各类溶剂的应激下，SXM 的蛋白形态和表达均受到一定程度的影响，在丙醇应激的情况下，SXM 不仅在形态上出现可逆的大幅度的变化，且其热激蛋白90等的表达也与正常SXM差别较大，含铁乙醇脱氢酶的表达也受到一定抑制，同时铁还原酶的活性也受到抑制。鉴于铁的异化还原是希瓦氏菌的特征之一，因此猜测丙醇对MTR 途径有一定影响。为进一步探究应激条件下基因水平的变化，对MTR 通道的三个基因mtrA、mtrB及mtrC进行了绝对定量PCR，基因的标准曲线及不同溶剂应激下的基因表达量如图4 所示。在丙醇应激下，mtrA、mtrB与mtrC基因的表达量较原始状态均有提高，提高量分别为13.3%、34.4%和147.6%。

为进一步解释丙醇应激产生的影响，依据定量PCR 结果推测了蛋白的变化，推测示意图如图5 所示。MtrB与MtrC均是与细胞外膜相结合的蛋白，而丙醇应激之后细胞的形态被拉长，因此需要更多的外膜蛋白以维持细胞外膜的完整性，mtrB及mtrC基因的表达量提高，可能带来了MtrB 及MtrC 蛋白的丰度提高，有利于维持细胞外膜的完整性以及维持SXM 在这一应激之下电子传递的稳定性。而mtrC基因的提高量远远大于其他基因，可能原因为MtrC蛋白是直接与外界电子受体相作用的蛋白，因此mtrC基因的大幅提高可能代表MtrC 蛋白的表达大幅增加，从而增强菌体与外界的电子传递，弥补由于铁还原酶活性降低造成的电子传递效率不足。此外，由于丙醇应激下，mtrA虽有提高，但提高量远远小于mtrB及mtrC，因此推测MtrA 蛋白的提高量有限，导致电子由细胞周质传递至细胞外膜这一过程受到了限制，因此与外界的电子传递并未增强，与铁还原酶的酶活受到抑制这一结果亦是相符合的。

表3 醇类应激下SXM产生的差异蛋白Table 3 Mascot protein identification of differential proteins produced by SXM under cultured in different alcohols

表4 不同溶剂应激时SXM的铁还原酶酶活Table 4 Fe reductase activities of SXM bearing different solvents

3 结 论

本研究考察了SXM 在八种不同有机溶剂下的耐受性，主要结论如下。

图4 MTR通道基因的标准曲线与不同溶剂应激下基因的表达量Fig.4 The quantification real time PCR(qRT-PCR)standard curves of genes of MTR pathway(mtrA,mtrB and mrtC)and gene expression level under solvent stress

图5 不同培养条件下MTR通道变化的推测示意图Fig.5 Proposed mechanism of electrons transfer through the outer membrane associated proteins (MtrA,MtrB and MtrC)under LB medium and 2%n-propanol in LB respectively

（1）可根据溶剂的亲水性（lgP值）初步判断SXM 对各溶剂的耐受性，SXM 对甲醇、乙醇、丙酮及DMSO 可耐受5%的浓度，对丙醇、异丙醇及叔丁醇可耐受2%的浓度，对于丁醇仅能耐受1%的浓度。不同有机溶剂对SXM 的形态与大小影响不同，丙醇应激下菌体被明显拉长，至少达到4～5µm，而丁醇应激下菌体则明显缩小，平均仅为1µm 左右，且变化是可逆的。

（2）在醇类应激下，SXM 通过调整蛋白的表达量来维持细胞的正常功能，TonB 受体、IucA/IucC 家族蛋白、磷酸葡糖酶亚基及含铁乙醇脱氢酶四个蛋白在醇类应激下表达量明显下调，热激蛋白90在丙醇与丁醇应激下表达量上调；丙醇及丁醇胁迫下，铁还原酶的活性收到抑制。

（3）丙醇对于MTR 通道相关基因的表达量有明显影响，丙醇应激下mtrB与mtrC基因的表达量显著提升，分别提高了34.4%和147.6%。根据蛋白电泳与定量PCR 的结果，对丙醇应激下的MTR 通道变化进行了推测，根据mtrB及mtrC基因表达量上调与丙醇应激造成的影响，推测在SXM 中MtrB 及MtrC蛋白与细胞形态等具有一定关联。