TWEAK及Fn14在衰老大鼠血管平滑肌细胞中的表达及意义

魏春阳,齐国先,王衍富，张 华，张多多

(1.中国医科大学附属第一医院 老年医学科，辽宁 沈阳 110001；2.大连医科大学附属第一医院 老年医学科，辽宁 大连 116011；3.大连医科大学附属第一医院 心律失常科，辽宁 大连 116011)

血管老化是心脑血管疾病一个重要的危险因素，管腔扩张和管壁增厚是血管老化最明显的结构特点，导致弹性动脉僵硬度增加、顺应性下降，同时血管修复、新生能力降低。血管平滑肌细胞衰老是血管老化主要机制之一，老化增厚的血管主要由肥大的平滑肌及间质构成。肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis， TWEAK)是配体超家族的新成员之一，与动脉粥样硬化密切相关，并参与心血管重塑的几种病理过程[1]，但TWEAK及其受体是否参与血管老化进程，目前尚未见研究涉及。本研究通过观察TWEAK及其受体成纤维细胞生长因子诱导蛋白14(fibroblast growth factor-inducing protein 14，Fn14)在血管平滑肌细胞衰老时的表达及作用，拟对TWEAK在血管老化中的作用有初步的认识。

1 材料和方法

1.1 实验样品及试剂

大鼠主动脉平滑肌细胞(A10细胞,万类生物ATCC来源，货号CRL-1476)、细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色试剂盒(Solarbio公司)、人AngⅡ(Aladdin公司)、TWEAK过表达腺病毒及其对照(GFP荧光标记)、TWEAK抗体(Abcam公司)、Fn14抗体(Bioss公司)、P53抗体(Abcam公司)、P21抗体(Rockland公司)。

1.2 血管平滑肌细胞培养与分组

A10细胞 10%胎牛血清培养基，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养3～5代。先将A10细胞分为对照组及AngⅡ组，经无血清培养24 h使细胞同步化后，对照组10%血清培养基培养，AngⅡ组10%血清培养基加1×10-7mol/L的AngⅡ培养1、3、7 d，检测各组细胞衰老情况。再将A10细胞分为对照组、未感染组、空载体组及TWEAK过表达组，经无血清培养24 h后，对照组、未感染组不做转染，空载体组及TWEAK过表达组分别转染空载体腺病毒及TWEAK过表达腺病毒。转染48 h后，未感染组、空载体组及TWEAK过表达组10%血清培养基加1×10-7mol/L的AngⅡ培养，对照组10%血清培养基培养，7 d后检测各组细胞衰老情况。

1.3 设计并合成TWEAK过表达腺病毒及其对照载体

根据NCBI数据库中TWEAK的CDS序列以及质粒图谱上的酶切位点设计TWEAK引物(引物由上海生工生物工程有限公司合成，见表1)。通过PCR进行基因扩增，利用多功能DNA纯化回收试剂盒(BioTeke)包装纯化PCR产物，得到的目的基因与pUM-T simple vector(BioTeke)连接，利用分子克隆方法扩增TWEAK DNA并构建腺病毒载体(GFP荧光标记)。空质粒包装腺病毒作为空载体组。培养VSMCs细胞，进行腺病毒转染。

表1 引物序列表

下划线部分是酶切位点

1.4 SA-β-Gal染色试剂盒检测细胞衰老

SA-β-Gal是一种可用来鉴别细胞衰老的特异性生物标志，细胞衰老时其活性升高，染色后胞内产生蓝色沉淀物即为染色阳性。按照染色试剂盒操作说明进行细胞染色。荧光显微镜下观察并拍照，每组随机选取视野，观察1 000个细胞，衰老的细胞染色质表现为蓝染，计数衰老细胞占细胞总数的百分比。

1.5 RT-PCR检测TWEAK mRNA水平

根据说明使用TRIpure试剂(BioTeke)从大鼠主动脉血管平滑肌细胞中提取总RNA。通过Super M-MLV反转录酶(BioTeke)将所得到的RNA样本进行反转录，以得到对应的cDNA。用SYBR Green(Solarbio)及ExicyclerTM96荧光定量仪(BIONEER)进行荧光定量分析，采用 2-△△ CT方法分析数据。引物序列见表2。

表2 引物序列表

1.6 Western blot检测TWEAK、Fn14、P53、P21蛋白表达

根据各组细胞每个样本的质量及体积加入相应体积的裂解缓冲液抽提蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白浓度。每组取40 μg蛋白经SDS-PAGE(浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%、12%、10%)分离后，电转移至PVDF膜。室温下用TBST缓冲液配制的5%(M/V)脱脂奶粉将膜封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，所有一抗均用5%(M/V)脱脂奶粉稀释(TWEAK 1∶1 000、Fn14 1∶1 000、P53 1∶500、P21 1∶500)。孵育一抗后的PVDF膜用TBST洗涤4次，加入5%(M/V)脱脂奶粉稀释羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000稀释)，37 ℃孵育45 min，TBST洗涤6次，ECL发光液显色。曝光后的PVDF膜进行抗体剥脱后(此实验中，指标Fn14、P21的目的条带与内参条带相差较远，故分开电泳，不做剥脱处理)，加入β-actin抗体及羊抗兔IgG-HRP，ECL发光液显色。最后用凝胶图像处理系统(Gel-PRO Analyzer软件)分析目的条带的光密度值，以目的蛋白和内参谱带灰度值的比值示目的蛋白的相对表达水平。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 AngⅡ作用下血管平滑肌细胞衰老情况

AngⅡ作用1 d、3 d和7 d后，SA-β-Gal 染色结果显示，随着作用时间延长，AngⅡ组 SA-β-Gal 染色阳性率增多，分别达到细胞总数目的(11.52±2.1)%、(32.30±5.25)%、(64.50±7.32)%，明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),见图1。Western blot检测结果显示，随着作用时间延长，AngⅡ组P53、P21蛋白表达均明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

AngⅡ作用1 d后便可见平滑肌细胞出现SA-β-Gal染色(蓝色)，作用3 d、7 d后SA-β-Gal染色阳性率逐渐增多，而对照组几乎无SA-β-Gal染色；*与对照组比较，P<0.05；比例尺：50 μm图1 AngⅡ不同作用时间SA-β-Gal染色Fig.1 SA-β-Gal staining with different time length

2.2 TWEAK及Fn14在AngⅡ诱导衰老血管平滑肌细胞中的表达情况

Western blot检测结果显示，AngⅡ分别作用1 d、3 d、7 d后，AngⅡ组TWEAK、Fn14蛋白表达均明显升高，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；随着AngⅡ作用时间延长，AngⅡ组TWEAK、Fn14表达呈时间依赖性增加，对1 d、3 d、7 d时TWEAK、Fn14分别进行组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.3 TWEAK过表达对血管平滑肌细胞衰老的影响

TWEAK过表达腺病毒感染血管平滑肌细胞48 h后，荧光显微镜显示转染成功(图4)，实时荧光定量PCR及Western blot检测显示TWEAK过表达组TWEAK mRNA及蛋白表达明显增多，与对照组及空载体对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5、图6A。未感染组、空载体组、TWEAK过表达组分别加入1×10-7mol/L的AngⅡ作用7 d后，Western blot检测显示TWEAK过表达组细胞在发生应激衰老过程中，Fn14及P53、P21蛋白表达明显增多，与对照组、未感染组、空载体组比较，差异有统计学意义(P<0.05),见图6B、C、D。

A：Western blot检测P53蛋白表达水平；B：Western blot检测P21蛋白表达水平；A1、A2、A3：对照组培养1、3、7 d；B1、B2、B3： AngⅡ组分别处理1、3、7 d。*与对照组比较，P<0.05图2 AngⅡ处理1、3、7 d后P53、P21蛋白表达的变化Fig.2 Expression of P53，P21 in VSMCs under AngⅡ administration

A：Western blot检测TWEAK蛋白表达水平；B：Western blot检测Fn14蛋白表达水平；A1、A2、A3：对照组培养1、3、7 d；B1、B2、B3： AngⅡ组分别处理1、3、7 d。*与对照组比较，P<0.05；#不同时间分组间比较，P<0.05图3 AngⅡ处理1、3、7 d后TWEAK、Fn14蛋白表达的变化Fig.3 Expression of TWEAK，Fn14 in VSMCs under AngⅡ administration

图4 腺病毒载体感染血管平滑肌细胞48 h后荧光照片(×200)Fig.4 GFP fluorescence photos of VSMCs transfected by adenoviral vectors 48 h after transfection(×200)

实时荧光定量PCR检测TWEAK mRNA表达平均相对含量，*与对照组、空载体组比较，P<0.05图5 TWEAK mRNA表达的变化Fig.5 Expression of TWEAK mRNA

3 讨 论

衰老是心脑血管疾病最不可忽视的危险因素，在人体衰老过程中血管老化表现得尤为突出，可导致血管壁增厚、血管弹性下降、管壁钙质增加、内皮功能减退，促进血管粥样硬化病变，造成心脑血管疾病发生率明显升高。血管平滑肌细胞是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，在血管老化中起着非常重要的作用。衰老的血管平滑肌细胞具有较低的增殖潜力和更高的活性氧(ROS)水平，并且与氧化应激所引起的损伤增加相关[2]，而ROS和核DNA损伤都是过早衰老的重要诱因[3]。血管平滑肌细胞还通过调节不同成骨细胞基因在进行复制性衰老时表达“骨细胞样”表型，增强其钙化的易感性[4]，进而导致血管壁钙质沉积。TWEAK是配体超家族的成员之一，Fn14是其最主要功能受体[1]。TWEAK与肿瘤样坏死因子(TNF)家族其他成员一样，具有激活炎症反应，参与调节细胞增殖、迁移、凋亡、血管生成和钙化等作用。近年来一些研究显示，TWEAK/Fn14与动脉硬化、胰和肾脏疾病、心力衰竭、腹部主动脉瘤等疾病密切相关[5]。TWEAK可通过核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化途径促进无机磷酸盐诱导的血管平滑肌成骨样转化[6]，诱导慢性炎症反应引起血管平滑肌细胞增殖、迁移[7]。另外也有研究显示，在老年小鼠骨骼肌中Fn14表达明显增多，TWEAK/Fn14促进年龄相关的骨骼肌萎缩与纤维化[8]。但TWEAK及其受体是否促进血管平滑肌衰老，参与血管老化进程，目前尚无研究涉及。

A：Western blot检测腺病毒感染48 h后TWEAK蛋白表达水平，*与对照组、空载体组比较，P<0.05；B：Western blot检测Fn14蛋白表达水平，AngⅡ诱导衰老7 d后，*与对照组、未感染组、空载体组比较，P<0.05；C：Western blot检测P53蛋白表达水平，AngⅡ诱导衰老7 d后，*与对照组、未感染组、空载体组比较，P<0.05；D：Western blot检测P21蛋白表达水平，AngⅡ诱导衰老7 d后，*与对照组、未感染组、空载体组比较，P<0.05图6 TWEAK及Fn14、P53、P21蛋白表达的变化Fig.6 Expression of TWEAK，P53，P21

血管平滑肌细胞的衰老表现符合细胞衰老的通常特点，如抑癌基因P16和或P21的上调、细胞和核肥大、SA-β-Gal积累等[9]。无论是端粒依赖性复制性衰老还是氧化应激、DNA损伤、癌基因激活等所致应激诱导性衰老，都受P53-P21和P16这两个经典通路调控，最终导致视网膜母细胞瘤抑制蛋白pRb活化，使转录因子E2F的失活，从而抑制细胞增殖。AngⅡ 可使细胞产生应激诱导性衰老[10]，被广泛使用于体内外血管衰老研究中，AngⅡ 诱导血管平滑肌细胞衰老模型有效且可重复[11]。本研究利用AngⅡ 处理大鼠主动脉血管平滑肌细胞，随着AngⅡ 作用时间的延长，血管平滑肌细胞SA-β-Gal染色增多，P53、P21表达增多，表明血管平滑肌细胞在AngⅡ 作用下出现应激诱导性衰老。与此同时，与对照组比较，TWEAK及Fn14在衰老的血管平滑肌细胞表达逐渐增多，提示血管平滑肌细胞衰老与TWEAK及Fn14关系密切。

为了进一步明确TWEAK对血管平滑肌细胞衰老的意义，我们设计合成TWEAK过表达腺病毒并成功转染血管平滑肌细胞。研究发现，血管平滑肌细胞发生应激诱导性衰老时，与对照组、未感染组及空载体组比较，TWEAK过表达腺病毒转染组Fn14、P53、P21表达明显增多，表明TWEAK可上调Fn14，对血管平滑肌细胞衰老过程具有促进作用。已有研究显示，TWEAK与Fn14结合，可以激活NF-κB信号通路[12]，NF-κB是与衰老密切相关的调节因子，抑制NF-κB信号通路有助于延缓衰老及衰老相关性疾病[13]，NF-κB在调节细胞衰老方案方面起着核心作用[14]。据此我们推测TWEAK/Fn14可能通过激活NF-κB信号系统促进血管平滑肌细胞衰老，这有待进一步的实验证实。

尽管本研究发现TWEAK可上调衰老细胞Fn14，促进血管平滑肌细胞衰老，但TWEAK/Fn14具体作用环节有待于更深入的研究，在此基础上进一步探讨对血管老化进程中的重要靶点进行干预，或可为临床上防治细胞衰老相关心血管疾病提供一个可利用的策略。