基于生物信息学方法探讨白花蛇舌草-半枝莲抗乳腺癌的分子机制

张誉宝 孙长岗

(1 青岛大学基础医学院，山东 青岛 266033； 2 山东中医药大学中医药创新研究院)

目前在全球范围内，乳腺癌(BC)患者约占所有癌症患者总数的1/3，是仅次于肺癌的女性第2大癌症死亡原因[1]。尽管包括放射疗法、化学疗法、手术和新辅助疗法在内的治疗方法已经获得显著成效，患者的存活率逐渐提高，但是由于副作用和多药耐药性等问题，高复发率和长期死亡率仍然严重威胁着患者健康[2-3]。因此临床迫切需要副作用低的新型治疗方法。

白花蛇舌草(HDW)作为一种传统中草药，主要功效包括清热、排毒和祛瘀。由于具有显著的抗肿瘤功效，在临床上已广泛用作多种肿瘤治疗的替代药物[4]。体外研究发现，HDW可通过Akt/ERK信号传导诱导线粒体介导的细胞凋亡，抑制胶质母细胞瘤的生长[5]；其提取物可以通过Ca2+/钙蛋白酶/caspase-4途径诱导乳腺癌细胞的凋亡[6]。半枝莲(SB)是临床中癌症治疗效果比较显著的常用药物，具有抗氧化、抗炎和抗癌等多种作用[7]。HDW-SB

是中医治疗BC的常用药对，在中医治疗癌症的多种方剂中，均可见这两种药物的配伍使用，如“二白二半汤”、“肺癌辅助治疗方”及“肿瘤和方”等方剂中[8-9]。其提取物可通过介导PI3K/AKT信号通路，发挥抑制人结肠癌HT29细胞的增殖、诱导细胞凋亡、阻止上皮间充质转化(EMT)作用[10]。与单独使用一种药物相比，HDW和SB配伍使用增强了抗肿瘤功效[11]，但具体的分子生物学机制并不明确。因此，本研究旨在通过构建药靶可视化网络并结合分子对接技术探讨HDW-SB治疗BC的分子机制，为HDW-SB的临床应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 筛选HDW-SB共同有效成分及有效成分潜在靶点基因

通过中药系统药理数据库(TCMSP)[12]获取HDW-SB的共同有效成分，筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似度(DL)≥0.18。通过TCMSP的靶点模块筛选出HDW-SB共同有效成分对应的潜在靶点，去重后，经Perl(https://www.perl.org/)和UniProt(http://www.UniProt.org/)转换为基因名称，获得HDW-SB有效成分的潜在靶点基因。

1.2 筛选BC组织与癌旁正常组织差异表达基因(DEGS)

通过基因表达综合数据库(GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取芯片GSE45827(包含130个BC组织样本和11个癌旁正常组织样本)，通过R平台的limma软件包筛选出BC组织与癌旁正常组织DEGs，筛选条件为|log2FC|≥1和P<0.05。再通过该平台的R包提取HDW-SB共同有效成分与BC DEGs的交集，以确定HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

将HDW-SB共同有效成分的潜在靶点基因和HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点全部输入到STRING数据库[13]中进行分析，预测两者的相互作用，最小相互作用阈值为0.400，物种为“智人”。将得到的相互作用数据再输入Cytoscape 3.7.1软件中[14]，分别构建以下网络：①BC DEGs的PPI网络；②HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点的PPI网络。使用CytoNCA插件对HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点PPI网络中的所有基因进行拓扑分析，结果排序后，选取前15位的靶点作为候选靶点。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

利用Cytoscape 3.7.1中的插件Clue Go对候选靶点从生物学过程(BP)、细胞组分(CC)以及分子功能(MF)3个层面进行GO富集分析，然后使用DAVID数据库[15]进行KEGG通路分析。结果均以P<0.05为具有生物学意义的临界值。

1.5 预后价值分析

用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)数据库(含有5 143例BC组织样本)评估候选靶点对患者总生存率(OS)和无复发生存率(RFS)的影响，获得与不良预后密切相关的关键靶点。以P<0.05为差异具有统计学意义。

1.6 分子对接分析

用PubChem数据库(http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取HDW-SB共同有效成分的分子结构，保存为mol2格式；利用RCSB蛋白质数据库[16](https://www.rcsb.org/)收集关键靶点所对应的蛋白结构信息；通过SYBYL-X软件对关键靶点所对应的蛋白结构和HDW-SB有效成分的分子结构进行分子对接分析，筛选核心有效成分，以对接分数>4认为具有显著意义。

2 结 果

2.1 HDW-SB共同有效成分及有效成分潜在靶点基因筛选结果

通过TCMSP数据库筛选出HDW有效成分37种，SB有效成分94种，去重后得到25种HDW-SB共同有效成分，经TCMSP的靶点模块筛选并构建HDW-SB共同有效成分及其潜在靶点基因的关系图(图1)。图中左边为HDW-SB共同有效成分，右边部分为有效成分对应的潜在靶点基因。

图1 HDW-SB共同有效成分及其潜在靶点基因关系图

2.2 PPI网络构建

通过limma包分析获得BC组织与癌旁正常组织DEGs 544个，包括185个上调基因和359个下调基因。通过CytoScape 3.7.1软件构建BC DEGs的PPI网络图，包含150个节点和599条边缘(节点与节点之间的连线)，其中蓝色节点代表低表达的基因，红色节点代表高表达的基因，节点的直径随边缘数量增加而增大。通过R包对HDW-SB共同有效成分和BC DEGs取交集，显示有15种HDW-SB共同有效成分调控了BC相关的23个潜在靶点，构建HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点PPI网络图(图2)，其中红色节点表示HWD-SB共同有效成分，蓝色六边形节点代表HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点，共有44条边缘。将上面所获得的23个靶点通过Cytoscape软件进行拓扑分析后，位于前15位的靶点作为候选靶点蛋白，分别为ESR1、EGFR、AR、RUNX2、CCNA2、PRKCD、CHECK2、CHEK1、HSPB1、SERPINE、GSTP1、FOS、NQO1、COL1A1及ODC1。

A:BC DEGs的PPI网络图,B：HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点的PPI网络图图2 BC DEGs及HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点的PPI网络图

2.3 候选靶点的GO富集分析和KEGG通路分析

GO富集分析结果显示，HDW-SB候选靶点在BP层面主要富集于活性氧的反应、雌二醇反应、氧化应激反应等方面。MF层面主要富集于DNA结合转录激活剂活性、转录因子活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、激酶调节剂活性、RNA聚合酶Ⅱ基础转录因子结合、转录共激活剂结合等方面。CC层面主要富集于囊泡腔、基底膜、转录因子复合物等方面。KEGG通路分析显示，HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点主要富集于雌激素信号传导途径、MAPK信号通路、细胞周期、趋化因子信号通路等关键通路(P<0.05)。

2.4 预后价值分析

对BC的15个候选靶点进行预后价值分析显示，HSPB1、CCNA2及NQO1与患者的OS和RFS密切相关，为与不良预后密切相关的BC关键靶点。

2.5 HDW-SB有效成分与BC靶点蛋白的分子对接分析

对关键靶点HSPB1、CCNA2和NQO1以及HDW-SB共同有效成分进行分子对接分析后显示， HDW-SB共同有效成分中quercetin、rhamnoside以及luteolin与BC关键靶点的分子对接分数最高；quercetin、rhamnoside和luteolin与HSPB1的对接分数分别为4.26、4.75、4.57；quercetin、rhamnoside以及luteolin与CCNA2的对接分数分别为5.41、4.71、5.70；quercetin、rhamnoside和luteolin与NQO1的对接分数分别为4.41、4.88、4.77。

3 讨 论

本研究运用网络药理学分析方法结合分子对接技术，揭示HDW-SB共同有效成分及其治疗BC的分子机制。首先通过构建BC DEGs的PPI网络和HDW-SB共同有效成分所调控的BC靶点的PPI网络，筛选出23个药物和疾病的共同靶点，再经拓扑分析从中筛选出15个候选靶点，进一步进行预后价值分析后显示，HSPB1、CCNA2和NQO1 3个靶点均与BC患者的OS以及RFS密切相关，可能是HDW-SB治疗BC的关键靶点。

对KEGG通路分析显示，MAPK信号通路与雌激素信号通路与BC的发生发展密切相关。先前研究表明，雌激素信号通路是参与ER+乳腺癌治疗的重要通路之一，也是正常乳腺发育和乳腺癌发生的关键调节通路[17-18]。多细胞生物中细胞增殖的调控是一个复杂的过程，MAPK通路涉及一系列蛋白激酶级联反应，在调节细胞增殖中发挥着关键作用[19]。此外，MAPK家族包括细胞外信号调节激酶(ERK)、Jun激酶(JNK/SAPK)和p38 MAPK，这些活化的激酶可以调节细胞的生长、分化、增殖、迁移以及凋亡，从而被认为是癌症治疗的潜在治疗途径[20]。

HDW-SB的有效成分quercetin是一种类黄酮化合物，广泛存在于天然植物中，具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化以及抗癌功效[21]。研究发现，quercetin可以有效抑制细胞周期蛋白1、p21、Twist以及磷酸化的p38 MAPK的表达，从而诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡[22]。Survivin为凋亡抑制蛋白家族的成员，与肿瘤的恶性程度和病理分型有关，其表达升高预示着患者的预后不良。研究表明quercetin可通过降低survivinmRNA的表达水平来提高BC细胞对化疗的敏感性[23]。HDW-SB的有效成分rhamnoside具有显著的抗血管生成特性，其可通过抑制血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)激酶的活化和磷酸化进程，从而对下游MAPK、丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)和信号转录激活因子3(STAT3)起到抑制作用[24]。在癌症进展过程中，VEGFR2在调节内皮细胞的有丝分裂和通透性中起着非常重要的作用[25]，其激活后可促进多种下游信号分子的磷酸化，包括MAPK、AKT和STAT3，从而促进肿瘤细胞的生长，以及内皮细胞的增殖、迁移和新生血管形成[26]。同时，rhamnoside还可以通过抑制VEGFR2及其下游信号调节因子的磷酸化，从而抑制肿瘤的新生血管生成，另外，luteolin是一种常见的类黄酮化合物，可诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖、转移和新生血管生成[27]。目前研究显示，luteolin可通过下调PI3K/AKT和MAPK/ERK通路抑制BC细胞的生长[28]。在本研究中，HDW-SB的有效成分quercetin、rhamnoside和luteolin与BC关键靶点对接分数最高，因此推测这3种有效成分可能是HDW-SB治疗BC的核心有效成分。

研究报道，HSPB1属于小应激蛋白家族，在IDCA乳腺癌细胞系中过表达，主要参与调节肿瘤的转移和扩散，可以通过与细胞质受体(VEGF、FGF-2、Her2)的相互作用促进组成性细胞分裂，进一步导致MAPK/MEK/ERK通路的过度活化[29]。CCNA2在各种肿瘤中均呈现过表达，是高度保守的细胞周期蛋白家族成员之一。研究表明，在HT-29和HCT116大肠癌细胞系中敲除CCNA2基因后，可显著阻滞大肠癌细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡，并直接抑制大肠癌细胞的生长，也许该基因可有望成为大肠癌的新的生物标志物[30]。NQO1过表达与乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、肺癌和胰腺癌的预后不良密切相关，并可通过上调X连锁凋亡蛋白(XIAP)的稳定性来抑制肝癌细胞的凋亡[31]。本文研究结果亦显示，HDW-SB有效成分中的quercetin、rhamnoside和luteolin与上述3个关键靶点均呈现出较高的对接分数，提示HDW-SB可能是通过调节HSPB1、CCNA2和NQO1发挥抗BC的作用。

总之，本研究通过网络药理学、生物信息学与分子对接技术相结合的方法，全面分析了HDW-SB共同有效成分治疗BC的分子机制，为揭示多组分中药的治疗机制提供了一种新的研究思路。