表面复合微/纳拓扑化丝素/壳聚糖/沙蒿籽胶水凝胶的制备及对雪旺细胞的影响*

韩琦，梁如宇，张李玲，张鲁中，吴红，杨宇民△，李贵才△

(1.南通大学神经再生江苏省和教育部重点实验室，南通 226001;2.南通大学神经再生协同创新中心，南通 226001;3.南通大学生命科学学院，南通 226001)

1 引 言

周围神经损伤是一种严重影响患者正常生活和健康的疾病[1]。修复周围神经损伤的金标准是自体移植[2]，但其组织供应来源有限。目前，随着组织工程和生物材料的发展，具有良好生物相容性、可降解性、安全无毒的各类生物材料支架正逐渐应用于周围神经损伤的治疗中[3]，如胶原、壳聚糖、聚丙交酯膜[4]和聚己内酯微纳纤维[5]等。

水凝胶是以水为分散介质而形成的凝胶，其吸水性、保水性、稳定性、柔软性高，生物相容性好，可作为组织工程材料，用于模拟人体组织[6]，对于组织的修复和再生起介导作用[7-8]。研究发现水凝胶支架对周围神经再生具有重要影响，黄锐等[9]用全氟三丁胺(PFTBA)水凝胶联合神经导管修复大鼠坐骨神经缺损，发现PFTBA水凝胶能很好地促进周围神经的修复与再生。为了提高水凝胶的力学性能[10]，Li等[11]制备出一种氧化石墨烯(GO)/聚丙烯酰胺(PAM)复合水凝胶，并证明水凝胶的疏水性和力学性能随着GO浓度的增加而增加，同时在PAM水凝胶中添加适当浓度的GO，可以有效促进雪旺细胞生长。

微模塑技术可在生物材料表面产生规整的微/纳米结构，用于模拟细胞生长的物理微环境。高均超等[12]制备了图案化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)软模板，软模板上的图案与硅片硬模板上完全一致。徐盼举等[13]利用微模塑技术制作出了一种图案规整的氧化石墨烯阵列，并证明该氧化石墨烯阵列具有促进PC12细胞粘附、增殖的作用。微拓扑结构能够调控细胞取向性生长，但目前多数研究仅评价了单一微米级或纳米级尺寸的拓扑结构对细胞行为的影响，鲜有构建兼具微米和纳米复合拓扑结构用于调控细胞的研究。

本研究联合采用溶胶凝胶技术及微模塑技术构建了表面具有微图形结构的丝素/壳聚糖/沙蒿籽胶(SF/CS/AS)水凝胶，壳聚糖具有良好的降解性能和抗菌性[14]，但壳聚糖水凝胶力学强度差[15]；丝素蛋白[16]具有良好力学性能，且可降解性和生物相容性高[17]；沙蒿籽胶是黏度较高的一种多糖类物质，在生物医学中可以作为增稠剂、稳定剂和乳化剂等。因此，构建SF/CS/AS水凝胶可以优势互补[17-18]，进一步提高自身的力学性能、生物相容性、成膜性，作为生物材料可以更好地应用到组织工程当中。本研究首先对该凝胶的表面形貌、力学性能进行了评价，进一步对成纤维细胞和雪旺细胞进行了生物学评价，表明具有微/纳拓扑结构的复合水凝胶可以促进雪旺细胞的黏附、迁移，期望该研究能够为周围神经损伤移植物的选择和制备提供一定依据。

2 材料与方法

2.1 实验试剂和设备

家蚕丝素(南通仙基达茧丝制品有限公司)；壳聚糖(江苏南通兴成生物制品厂)；沙蒿籽胶(宁夏绿洲草业有限公司)；NaOH(西陇化工股份有限公司)；生理盐水(Gibco公司)；无水乙醇(永华化学科技有限公司)；Na2CO3(西陇化工股份有限公司)；化锂(上海迈瑞尔化学技术有限公司)；CH3COOH(Dow Corning公司)；PBS缓冲液(Corning公司)；NaH2PO4·12H2O(西陇科学股份有限公司)；NaH2PO4·2H2O(西陇科学股份有限公司)；甲苯胺蓝(Sigma-Aldrich公司)；罗丹明(Sigma-Aldrich公司)；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma-Aldrich公司)；HCHO溶液(西陇科学股份有限公司)；DMEM基础培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；生理盐水(Gibco公司)；胰酶(Gibco公司)；胶原酶(Gibco公司)；细胞表面抗原重组蛋白(Thy，Gibco公司)；多聚赖氨酸(PLL，Gibco公司)。

电子分析天平(shimadzu公司，日本)；磁力搅拌机(巩义市英裕予华仪器厂)；超声震荡仪(张家港市科宇信超声有限公司)；光学显微镜(德国Leica公司)；紫外超净台(上海医疗器械有限公司)

2.2 实验方法

2.2.1实验试剂配制 文献[19]中的方法配制丝素蛋白溶液。配制壳聚糖溶液时，先配制2%的CH3COOH溶液，再用电子分析天平分别称取5、2.5、1 g壳聚糖粉末倒入烧杯，加入配好的乙酸溶液，在磁力搅拌机上搅拌1 d，得到5%、2.5%、1%壳聚糖溶液，装入试剂瓶中，于4℃冰箱中保存备用。最后配制沙蒿籽胶(AS)溶液，分别称取0.1、0.2、0.4 gSA粉末溶于10 mL双蒸水中，充分混匀后，制得1%、2%、4%SA溶液。

2.2.2SF/CS/AS共混胶的制备 将丝素溶液、壳聚糖溶液、沙蒿籽胶粉末按照：10%丝素溶液0.1 mL、2.5%壳聚糖溶液5 mL、沙蒿籽胶粉末100 mg；10%丝素溶液0.5 mL、2.5%壳聚糖溶液5 mL、沙蒿籽胶粉末100 mg；10%丝素溶液0.1 mL、1%壳聚糖溶液5 mL、沙蒿籽胶粉末100 mg；10%丝素溶液0.5 mL、1%壳聚糖溶液5 mL、沙蒿籽胶粉末100 mg配制四组共混胶溶液，依次加入10 mL离心管中并做好相应标记(分别为A、B、C、D)，放入超声震荡仪超声15 min，并用玻璃棒搅拌，使之充分混匀。

2.3 图案化共混胶膜的制备与处理

2.3.1图案化共混胶膜的制备 分别取A、B、C、D组的共混胶50 μL滴在干净的小圆玻片上，将洗净的PDMS印章有图案的一面压在液滴上，并使液滴完全覆盖图案，见图1。在通风干燥实验台上自然风干3 d后，将印章与玻片剥离，可得完整的图案化共混胶膜。再将此膜在4%NaOH溶液下浸泡30 min进行脱酸处理，用去离子水洗至pH中性，放入冰箱中保存备用。

图1 图案化共混胶膜制备过程

2.3.2共混胶膜光镜拍照 将图案化共混胶膜在光学显微镜下进行形态学观察，包括凹槽宽度的各种差异，并利用光学显微镜进行拍照观察。通过放大20倍并拍照记录，可以看出该图案含有好几种不同宽度的凹槽，且宽窄交替排列。

2.4 细胞毒性检测

2.4.1成纤维细胞的接种 首先对材料进行消毒和灭菌，每组设置三个平行样放置于24孔板中，标记，在孔板中加入1 mL酒精浸泡30 min后用PBS简单清洗3次，再将孔板放入紫外超净台下照射30 min。将成纤维细胞稀释为2×104cells/mL，每孔分别种1 mL细胞液，放入培养箱，培养1、3、5 d后移除细胞液，加4%的HCHO固定。

2.4.2甲苯胺蓝染色 选出在共混胶膜上培养1 d的成纤维细胞，用PBS清洗3～5遍，每个玻片上加入200 μL的甲苯胺蓝染液，置于常温下染色15～20 min，用PBS洗涤3～5次，然后放置于光学显微镜下拍照。利用ImageTool图像处理软件统计细胞数量，并用Origin软件做出统计图。

2.4.3DAPI染色 在24孔板中培养了1、3、5 d的成纤维细胞用PBS清洗后，向每个玻片上加入20 μL的DAPI染液(5 μg/mL)，玻片染色30 min，用PBS清洗3遍后，用荧光显微镜观察，整个过程避光处理。

2.4.4罗丹明染色 向每个玻片上均匀加入20 μL罗丹明染液(5 μg/mL)，染色30 min后，吸取PBS 1 mL加入孔板中，清洗玻片3遍，荧光显微镜观察并拍照，整个过程要进行避光，避免荧光强度减弱。

2.5 雪旺细胞的粘附、铺展研究

2.5.1雪旺细胞的接种 将制作好的图案化玻片以及无图案化(2.5%CS+100 mgAS)对照组正面朝上放进灭菌后的24孔板中，雪旺细胞(RSC96)的接种同成纤维细胞，见2.4.1节。培养板每孔分别种1 mL细胞液，培养1 d后加4%的HCHO固定。

2.5.2雪旺细胞的甲苯胺蓝染色 用4%HCHO固定培养1 d的雪旺细胞，然后PBS清洗3～5次，对玻片进行甲苯胺蓝染色，染色方法见2.4.2节。然后在光学显微镜下进行拍照记录。利用Image软件和Origin软件分析细胞存活、增殖以及生长形态。

2.6 统计分析

实验数据采用SPSS17.0进行分析，组间样品比较采用One-way ANOVA,P<0.05为显著性差异，数据表示为mean±SD。

3 结果与讨论

3.1 图案化共混胶膜光镜拍照

首先对样品采用光学显微镜进行拍照观察，通过放大20倍得到的图片(见图2)，可以看出该图案含有10种不同宽度的凹槽，且宽窄交替排列。将微图案在显微镜下拍照后，利用ImageJ软件对凹槽的宽度进行测量，根据凹槽宽度的差异，将该微拓扑结构分为9个区域，编号I—IX区。第I区凹槽宽度为20 μm，第II区凹槽宽度主要为5 μm，第III区凹槽宽度为9 μm，第IV区凹槽宽度较大，由33 μm和16 μm组成，第V区凹槽宽度由16 μm和3 μm组成，第VI区凹槽宽度为16 μm和9 μm，第VII区凹槽宽度则由40 μm和30 μm组成，第VIII区凹槽宽度为30 μm和5 μm，第IX区凹槽宽度则由30 μm和9 μm组成。结果表明，本研究成功地将PDMS印章通过微模型法在玻片表面制作了具有微/纳复合的图案化结构。

图2 20倍光镜下微/纳米图案化共混胶膜结构(单位长度：100 μm)

3.2 细胞毒性检测结果分析

3.2.1成纤维细胞甲苯胺蓝染色 将培养1 d后的成纤维细胞TBO染色后，在显微镜下观察。由图3可知，对于无微图案的空白组，成纤维细胞生长比较杂乱。而对于有微/纳米条纹图案的实验组，成纤维细胞沿条纹微图案生长明显，特别是在CS浓度为5%的微图案上，细胞的取向性生长更为明显，而CS浓度为2.5%的微图案上，细胞沿条纹微图案生长的趋势要比5%CS的样品弱。同时可以看出，生长于较小的条纹凹槽宽度的细胞取向性更好，大部分细胞能呈长梭形沿条纹生长。

图3 成纤维细胞的TBO染色图(单位长度：100 μm)

通过ImageTool软件对20倍光镜照片进行细胞计数。由图4可知，培养1 d后，在CS浓度为2.5%和5%的微图案膜上细胞数量无显著差异，且有图案和无图案的共混胶膜上细胞数量差异也不大。实验结果表明，成纤维细胞在复合水凝胶制作的微图案膜上数量较多且生长良好，说明该材料经脱酸处理后，对细胞无毒性，其可以用于研究对细胞生长行为的调控。

3.2.2成纤维细胞荧光染色 对接种有成纤维细胞的微图形共混胶膜分别培养1、3、5 d，染色后利用ImageJ软件进行细胞计数，见图5。由图5可知，在同一个CS浓度下，细胞数量随着培养天数的增加而增多。并且在相同时间点，CS浓度为5%的微图案上的细胞数量比浓度2.5%的微图案多，但数目相差不大。

注：2.5*：2.5%CS+100 mg AS无图案；5%*：5%CS+100 mg AS无图案；2.5%：2.5%CS+100 mg AS有图案；5%：5%CS+100 mg AS有图案。

图5 第1、3、5 d成纤维细胞数量统计图

利用罗丹明以及染料DAPI分别对培养1、3、5 d的成纤维细胞染色后，用荧光显微镜对同一位置的细胞核和细胞骨架，在20倍物镜下进行拍照，利用PS软件将细胞核与细胞骨架合成得到图6。利用合成图，能够看出细胞在微图案上有较明显的取向性生长，即有沿着微图案条纹生长的趋势，且CS浓度为5%的微图案上的细胞沿着条纹凹槽生长趋势更加明显，这和甲苯胺蓝染色结果相符。

图6 成纤维细胞的荧光染色图(红光图为罗丹明染色图，蓝光图为DAPI染色图,单位长度：100 μm)

3.3 雪旺细胞粘附和铺展研究

通过对接种有雪旺细胞的4组图案化以及无图案共混胶膜培养1 d后，统计细胞数量，由图7可知，4组图案化共混胶膜上的都有较多细胞生长，说明雪旺细胞能够很好地粘附于该材料上，且B组细胞数量最多，而C组细胞数量最少。由图8可知，四组带有微/纳拓扑结构的共混胶膜上的细胞均能够沿凹槽生长，且通过放大40倍的照片能够看出，D组对于雪旺细胞生长取向的引导作用更强，而对照组E组对雪旺细胞取向性无诱导作用。细胞在微图案上的铺展具有一定的取向性，这对于长距离的受损神经修复有促进作用，与Turunen等[20]的实验结果相一致。

图7 A、B、C、D、E五组培养1d后雪旺细胞数目统计图

图8 A、B、C、D、E五组培养1d后雪旺细胞光镜图(左图红色框为所选区域，右图为该区域40倍放大图)

微图案共混胶膜上的微/纳拓扑结构并非单一尺寸，而是由9种不同尺寸组合而成，已将9个区域分为Ⅰ—Ⅸ区，对9个区域上的雪旺细胞进行取向角分析。图9中，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区上的取向角低于10°，说明细胞几乎是沿着凹槽生长的。这是因为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区上的凹槽只有一种尺寸，且凹槽尺寸较小，窄条纹限制细胞的垂直扩散，使得细胞沿着条纹方向水平生长，故对雪旺细胞的生长能够起很好地引导作用。而Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ区的细胞取向角高于20°，这是因为这三个区域均为两种较大尺寸的混合凹槽，故对细胞的取向性引导作用不强。而Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ区上的细胞取向角介于10至20之间，且Ⅴ与Ⅶ、Ⅸ区域凹槽的尺寸为一大一小两种尺寸混合组成。

图9 雪旺细胞在I—IX区上的取向角统计图

关于微图案调控细胞生物学行为的研究已经有大量报道。不同于前人使用单一微图案拓扑结构，本研究采用复合型的微/纳米结构，即在一个基底平面上含有包括微米级和纳米级等9个区域，10种不同尺寸的凹槽，更好地模拟了人或动物体内的生理组织结构。通过细胞评价可以发现，本研究所涉及的微/纳米复合结构能够促进神经细胞轴突再生，对细胞的附着、迁移、生长和分化均有一定积极作用。

4 结论

本研究通过联合采用溶胶凝胶技术及微模塑技术，成功构建了表面具有复合微拓扑结构的SF/CS/SA复合水凝胶，该复合水凝胶无细胞毒性，雪旺细胞能够在具有微图形结构的复合水凝胶膜上很好生长，并且该微/纳拓扑结构对雪旺细胞的生长取向具有很好地调控作用。该研究的开展将为微纳拓扑化人工神经移植物修复周围神经损伤提供理论和实验依据，对于开发组织工程的神经移植物具有十分重要的指导意义。