低频变化电场促进细胞定向移动的研究*

李颖，Bing Song，殷涛，刘志朋△

(1.中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津 300192；2.中国科学院深圳先进技术研究院生物医学与健康工程研究所转化医学研究与发展中心，深圳 518055)

1 引 言

细胞通过响应电、化学、机械等信号实现定向移动[1]，而电信号引导的细胞迁移对伤口愈合至关重要[2-3]。1794年，Galvani用青蛙坐骨神经断端引起对侧大腿肌肉收缩，开启了神经电生理研究的序幕，但同时期电刺激治疗的滥用和检测设备的缺乏阻碍了损伤电位研究的发展[4]。二十世纪七十年代，Borgens等[5]发现在愈合过程中，蝾螈断肢周围的生物电流变化明显。随后，研究人员分别在哺乳动物[6]以及人类皮肤[7]中发现了经上皮电位，并证实其能够加速上皮形成并促进结缔组织迁移[8]。二十世纪九十年代，Nishimura等[9]和Zhao等[10]发现细胞在外加电场作用下发生定向移动，该现象称为细胞趋电性(Galvanotaxis或Electrotaxis)。2006年，Zhao等[11]指出外加电场可激活Src和肌醇-磷酯信号通路，通过基因手段调控PI3K和PTEN通路可调节细胞趋电性，进而影响伤口愈合过程。近年来，研究发现与细胞趋电性有关的因素有电场的波形[12]、强度[3-14]、梯度[15]和频率[16]，以及聚合物粘度[17]、胞外ATP[18]和基质特性[19-20]等，而在机制研究方面涉及蛋白表达[21]、Ca2+入涌[22]、肌动蛋白、VGSC[23]和CMF[24]、DIF[25]、Na+转运[26]、ADAM17[27]、PMPD[28],以及干细胞疗法[29]与癌症发展[30-31]等。

众多细胞，如角膜上皮细胞、神经元和脊髓细胞，角化细胞和阿米巴细胞等，在直流电场下能够向负极移动，另外一些细胞，如乳腺癌、肺腺癌细胞、真皮成纤维细胞、Schwann 细胞等能够向正极移动[32-33]。另一方面，多种非直流电场都能够在临床上有效促进伤口愈合[34-35]，且具有更小的电化学反应和细胞毒性[36]。我们的前期研究[37]证实，脉冲直流电场和双极性脉冲电场都能促进细胞定向迁移：90%占空比脉冲直流电场和80%双极性脉冲电场比直流电场更好，而电中性脉冲电场下细胞虽运动方向随机而迁移速率却最高。然而，该研究局限于脉冲波电场，并未涉及其他波形的非直流电场。基于此，本研究设计能产生连续变化波形的BME-A500电刺激器，在趋电性小室中分别产生10、5、1 Hz的正弦波、三角波和斜坡波电场，以延时摄影系统记录电场下阿米巴细胞的运动影像，追踪细胞运动轨迹并分析对比其运动特性。

2 材料和方法

2.1 电刺激器的设计及波形实现

与前期研究中BME-P500脉冲电刺激仪[37]不同，本研究的电刺激器用于在趋电性小室产生非脉冲波形的非直流电场，波形设定为斜坡、正弦波、三角波等。设计了BME-A500型电刺激仪，包含电源电路和信号放大电路两个部分，见图1。实验中电场参数见表1，电场名称中S、T、R分别表示正弦波、三角波和斜坡波，A、B、C分别表示频率为10、5、1 Hz；f表示频率(单位Hz)，t表示周期(单位s)，VH表示最高电压(单位V)，VL表示最低电压。由于小室中盖玻片桥长度为1 cm，因此，本研究电场峰值为10 V/cm。

图1 电刺激设备原理图

表1 电场参数设定

2.2 细胞培养、轨迹追踪和数据分析

阿米巴细胞(AX2，野生型)在21 ℃阴凉柜的培养皿中培养，随后在摇床上大量培养。控制足够数量，用cAMP溶液刺激4 h[37]。制作趋电性小室，与缓冲、盐桥和电刺激器构成回路，细胞注入小室20 min后施加电场开启延时摄影[37]。细胞的追踪以及轨迹呈现使用ImageJ，以导向性(cos θ)和迁移速率(单位μm/min)衡量细胞趋电性[37-38]。本研究数据统计方法为单因素方差分析，无对照组的两两比较使用Tukey法，有对照组的使用Dunnet方法。

3 结果

3.1 不同频率正弦波电场下细胞运动特性对比

为了研究不同频率正弦波电场下细胞的运动特性，使用上述电刺激器在趋电性小室中施加10、5、1 Hz正弦波，分别得到相应的细胞运动轨迹，见图2。对三种电场下的细胞导向性进行方差分析，发现三者间具有显著差异(P<0.01)，说明正弦波电场的频率变化对细胞导向性具有影响，组间对比发现5 Hz与1 Hz电场下细胞导向性具有显著差异(P<0.01)：细胞在5 Hz具有更高的方向特性。对比三者迁移速率：10 Hz(17.02±3.33，n= 240)、5 Hz(17.72±3.56，n=240)、1 Hz(17.62±3.09，n=240)，发现具有统计学差异(P<0.05)，说明频率变化对其迁移速率具有影响，但组间两两对比没有明显差异(SA对SB=ns，SA对SC=ns，SB对SC=ns；ns即P>0.05)。综合考虑，5 Hz正弦波电场下细胞趋电性最好。

3.2 不同频率三角波电场下细胞运动特性对比

为了研究不同频率三角波电场下细胞的运动特性，使用上述电刺激器在趋电性小室中施加10、5、1 Hz三角波，分别得到相应的细胞运动轨迹，见图3。

注：图中正负号分别代表实验电极正负极，箭头表示电场方向，正电极位于趋电性小室的左侧或右侧由实验次序决定。**P < 0.01。

图3 三角波电场下细胞运动分析

对三种电场下的导向性进行方差分析，发现不具有统计学差异(ns)，说明三角波电场的频率变化对导向性无影响，而组间对比发现也不具有统计学差异(ns、ns、ns)。对比三者迁移速率：10 Hz(16.83±3.80，n=240)、5 Hz(18.63±3.36，n=240)、1 Hz(14.78±3.48，n=240)，发现具有统计学差异(P<0.001)，说明三角波电场的频率变化对迁移速率具有影响；组间两两对比都具有明显差异(P<0.001，P<0.001，P<0.001)，说明5 Hz三角波电场下细胞运动最快。综合考虑，5 Hz三角波电场下细胞趋电性最好。

3.3 不同频率斜坡波电场下细胞运动特性对比

为了研究不同频率斜坡波电场下细胞的运动特性，使用上述电刺激器在趋电性小室中施加10、5、1 Hz斜坡波，分别得到相应的细胞运动轨迹，见图4。对三种电场下的导向性进行方差分析，发现具有统计学差异(P<0.001)，说明斜坡电场的频率变化对导向性具有影响，且组间分析发现10 Hz对比5 Hz和1 Hz分别具有显著差异(P<0.001，P<0.001，ns)，说明10 Hz斜坡波的导向性最小。对比三者迁移速率：10 Hz(18.93±4.16，n=240)、5 Hz(19.28±3.30，n=240)、1 Hz(18.49±3.24，n=240)，发现无显著差异(ns)，说明斜坡波电场的频率变化对迁移速率不具有影响，但组间对比发现5 Hz和1 Hz电场下细胞迁移速率具有显著差异(ns，P<0.05，ns)，说明细胞在5 Hz斜坡波比1 Hz运动更快。综合考虑，5 Hz斜坡波下细胞趋电性最好。

注：***P < 0.001。

3.4 三种波形最优场与直流电场和脉冲电场下细胞运动特性对比

为了从以上三种波形中选择最优波形，以前期研究[37]中直流电场和50%占空比脉冲电场下细胞运动特性作为对照组，见表2，其中50%占空比脉冲电场下细胞与直流电场相比，导向性较小，迁移速率较慢。发现以直流电场的导向性为对照组，三种波形与之相比，具有显著差异(P<0.001)，且5 Hz三角波明显劣于直流电场对照组(SB对直流电场对照组= ns，TB对直流电场=P<0.01，RB对直流电场= ns)；同时以直流电场的迁移速率为对照组，三种波形与之相比，具有显著差异(P<0.001)，且5 Hz斜坡波明显优于直流电场对照组(ns，ns，P<0.001)。以脉冲电场的导向性为对照组，三种波形与之相比，也具有显著差异(P<0.001)，且5 Hz斜坡波明显优于脉冲电场对照组(ns，ns，P<0.001)；同时以脉冲电场的迁移速率为对照组，三种波形与之相比，具有显著差异(P<0.001)，且三种波形均优于对照组(P<0.001，P<0.001，P<0.001)。

表2 本研究三组不同波形电场中最优与直流电场和脉冲电场下细胞运动特性对比

综上，由导向性和迁移速率两方面考虑，5 Hz斜坡波电场下细胞具有最优的趋电性。

4 讨论和结论

本研究设计并制作了能产生连续变化电场的电刺激器，用于在趋电性小室中产生三种不同频率的三种非直流电场波形，记录、分析和对比阿米巴细胞在不同电场下的运动特性。结果发现正弦波、三角波和斜坡波电场下，5 Hz比10 Hz和1 Hz的细胞趋电性都更好；把上述三者与前期研究的直流电场和脉冲电场细胞运动相比，发现5 Hz斜坡波电场下细胞导向性不亚于直流电场，且迁移速率最好，该波形电场是本研究中细胞趋电性最优的电场。

施加电场的幅值、工作频率、波形和总体极性都能改变细胞的运动特性。本研究中正弦波、三角波和斜坡波均具有正向偏置，因此，这三种电场整个波形在任意时刻都具有非负电压，从而在单位周期内正负电极的电荷积累均不为零，结果细胞均具有明显的向负极移动特性，说明单位周期内电荷积累的总体极性最终决定细胞所能感受的“电方向指引”(Electrically Directional Cue)。Babonapilipos等[12]发现室管膜神经前体细胞在电中性双极脉冲电场下发生随机运动，而我们的前期研究[37]也发现阿米巴细胞在5 Hz和10 Hz电中性脉冲电场下运动方向随机而迁移速率增强。我们猜测在临床研究中，电中性变化电场促进伤口愈合的原因可能是由上述两研究证实的电场促进细胞迁移速率增强，而非细胞导向性增加。Hart等[39]发现直流电场叠加交变电场使细胞导向性比直流电场更高，迁移速率略低，并推论变化电场影响负电荷糖萼与基质间吸附力，从而影响细胞移动性；本研究的电场设计可理解为在直流5 V/cm电场基础上叠加幅值为±5 V/cm双极正弦波、三角波和斜坡波，但本研究结果与该研究略有不同：发现叠加电场的细胞导向性不优于直流电场，但斜坡波迁移速率优于直流电场，这可能是由本研究设计波形的非对称性，特别是斜坡波的上升沿与下降沿的明显差别对细胞趋电性影响不同造成的。我们的前期研究[37]发现，10 Hz脉冲电场下细胞趋电性优于5 Hz，但本研究发现正弦波、三角波和斜坡波不支持此观点，5 Hz电场下细胞趋电性反而比10 Hz更好，提示波形变化对细胞趋电性的影响可能大于频率变化。本研究发现与三角波与正弦波相比，斜坡波具有更好的细胞迁移速率，可能是因为斜坡波具有更大的电压变化率：在最高电压10 V时，斜坡波的上升沿的电压变化率与脉冲波接近，远大于10 V/ms；与之相比，三角波和正弦波的电压变化率分别为0.1 V/ms和更低，该结果与前期研究[37]中脉冲电场结果一致。本研究的主要不足是仅分析了单向正弦波、三角波、斜坡波电场下的细胞趋电性，并未分析这三种电场具有负向波形的情况，并且本研究施加电场的频率较低，后续将在这些方面进一步改进并探索。