鹿茸多肽促进组织工程肌腱修复大鼠髌韧带缺损的研究

张国荣，李庆杰，刘增霞

(1. 长春中医药大学临床医学院，吉林 长春 130117；2. 长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021；3. 长春中医药大学护理学院，吉林 长春 130117)

肌腱连接肌肉与骨骼，承受张力，其属于致密结缔组织，内含有大量纵向排列的胶原纤维束，在纤维束之间存在少量细胞和血管[1]。过度活动可能会引起肌腱及周围组织无菌性炎症反应，当外来应力超过肌腱本身强度时，肌腱有被撕裂的可能[2]。由于肌腱组织内细胞较少，血液供应较差，所以损伤后愈合缓慢，容易发生重复断裂，而且易与周围组织粘连[3]。断裂肌腱的治疗手段主要是手术缝合，配合理疗促进功能恢复[4-5]。如果发生组织缺损，则需要进行自体移植或异体移植，但由于供体有限和免疫排斥等因素影响，肌腱损伤修复的治疗效果一直不甚理想，是临床的难题之一。组织工程与细胞治疗技术的发展为肌腱损伤修复带来新的希望，组织工程肌腱是将种子细胞在体外培养增殖后，种植在支架材料上，在多种因素影响下，二者结合形成肌腱样组织复合物，肌腱细胞是肌腱组织内的细胞成分，具有合成和分泌胶原蛋白等细胞外基质，维持肌腱组织新陈代谢的作用，故可以用于肌腱缺损修复[6-7]。也有研究者尝试用各种生长因子促进肌腱愈合[8-9]。鹿茸是名贵中药，《神农本草经》最早记录鹿茸能加速创伤愈合，《本草纲目》记载鹿茸能生精补髓、养血益阳、强筋健骨。鹿茸多肽是从鹿茸中分离纯化出的多肽生长因子，其具有促进成纤维细胞增殖和胶原蛋白分泌的作用[10]。本研究在应用肌腱细胞构建组织工程肌腱治疗大鼠髌韧带缺损的基础上加入鹿茸多肽，探讨其是否有利于肌腱细胞增殖和胶原蛋白分泌，促进损伤肌腱修复。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 36只健康SD大鼠，体重200～250 g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物合格证号：SCXK-(吉)2018-0007。常规饲养于长春中医药大学SPF级动物房，普通饮食，自由饮水，室温(22±2)℃，相对湿度(55±5)%，自然昼夜节律光照。

1.2组织工程肌腱的制备 在无菌环境下取SD大鼠跟腱，剥离肌腱腱膜，用手术剪将组织剪成匀浆状。取适量(1 mL/mm3)混合胶原酶加入培养皿中，放入37 ℃培养箱中消化4 h。加入含血清(10%FBS)的低糖培养基将胶原酶浓度稀释到0.5%,37 ℃消化过夜。1 500 ×g离心5 min，弃上清，加入低糖培养基(10%FBS，1%抗生素)置于培养箱中培养。原代细胞4～5 d贴壁，贴壁后3 d更换1次培养基，当细胞生长到培养皿底大约90%时，传代培养。常规冻存复苏细胞，实验应用五代以内的大鼠肌腱细胞。参照文献[11]培养大鼠肌腱细胞，培养基中加入1%维生素C，以促进细胞分泌细胞外基质，并防止细胞老化。3 d更换1次培养基，培养2周后，在培养皿底部逐渐形成连续的细胞片。使用1 mL移液器枪头用向上的剪切力慢慢卷起细胞片，形成圆柱形组织。继续培养1周，细胞片的光滑面与粗糙面就会充分融合，形成组织工程肌腱。

1.3组织工程肌腱的微细结构检测 取组织工程肌腱，PBS润洗，10%甲醛溶液固定24 h。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸润，纵向包埋。7 μm厚连续切片，分别进行苏木精-伊红(HE)染色和三色(Masson)染色。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。在光学显微镜下观察组织微细结构。HE染色显示组织工程肌腱中细胞生长良好，大致成行分布，细胞外基质丰富，排列较疏松，Masson染色显示组织工程肌腱有成束的、连续的波浪状胶原纤维生成即为合格。

1.4鹿茸多肽处理组织工程肌腱 鹿茸多肽由长春中医药大学附属医院提供。按鹿茸多肽与组织工程肌腱质量比为1.5%计算[12]，将鹿茸多肽粉末溶解于适量PBS溶液中，将组织工程肌腱放入其中，充分浸润鹿茸多肽溶液。

1.5动物分组、造模及干预 将36只SD大鼠随机分为3组，每组12只，每只大鼠均在左侧膝关节内侧进行手术操作。模型组在髌韧带上做1 mm×4 mm全层窗口缺损，直接缝合，自然修复。组织工程组在髌韧带缺损处植入组织工程肌腱修复缺损组织，组织工程复合鹿茸多肽组在髌韧带缺损处植入用鹿茸多肽处理过的组织工程肌腱修复缺损组织，然后缝合膝关节囊、肌肉筋膜组织和皮肤切口，包扎处理。术后连续3 d每日肌肉注射80万IU青霉素。标准动物饲料喂养，每日紫外线消毒。每天观察动物饮食、活动、步态、伤口愈合情况、有无感染征象等。

1.6检测指标及方法

1.6.1大体观察 术后4周，处死各组大鼠，观察肌腱缺损部位修复情况，包括修复程度、表面平整度、颜色变化、与周围正常肌腱的整合情况、有无裂隙等。

1.6.2组织学观察 取大鼠髌韧带缺损处修复组织，制作石蜡切片，分别进行HE染色和Masson染色，用光学显微镜观察修复组织内部微细结构。

1.6.3胶原含量测定 精确称取湿重50 mg的修复组织，放入10 mL试管中，加入水解液1.0 mL，混匀。加盖后沸水浴水解20 min，中间混匀1次。流水冷却，加指示剂1滴，混匀。加入调pH甲液1.0 mL，混匀，此时溶液为红色。逐滴加入调pH乙液，及时混匀，直至液体变为黄绿色，此时pH值在6.0～6.8。向管内加蒸馏水至10 mL，混匀，取3 mL液体加20～30 mg活性炭，混匀，3 500 r/min(离心半径13.5 cm)离心10 min，上清液澄清无色即可，取上清1 mL做检测。空白管加蒸馏水1 mL，标准管加5 μg/mL 标准应用液1 mL，测定管加检测液1 mL，每管中加试剂一各0.5 mL混匀，静置10 min，然后每管中加试剂二各0.5 mL混匀，静置5 min，加试剂三各0.5 mL混匀，60 ℃水浴15 min，冷却后，3 500 r/min(离心半径13.5 cm)离心10 min，取上清200 μL用酶标仪在550 nm处测定吸光度。羟脯氨酸含量(μg/mg 湿重)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量(5 μg/mL)×水解液总体积(10 mL)/组织湿重(mg)。

2 结 果

2.1各组大鼠修复组织大体情况 术后4周，3组大鼠膝关节无肿胀、积液和感染征象。模型组修复组织外观不平整，周围组织有皱缩现象；组织工程组修复组织较平整；组织工程复合鹿茸多肽组修复组织平整光滑。见图1。

图1 各组大鼠术后4周肌腱缺损部位修复情况

2.2各组大鼠修复组织HE染色和Masson染色表现 术后4周， HE染色显示：模型组生成较多瘢痕组织；组织工程组组织结构规则，但组织工程肌腱与大鼠原有肌腱组织之间存在缝隙；组织工程复合鹿茸多肽组修复组织内部结构规则良好，缝隙较小。Masson染色显示：组织工程组与组织工程复合鹿茸多肽组均生成较多胶原纤维(蓝色)，而模型组胶原纤维较少。见图2。

图2 各组大鼠术后4周肌腱缺损部位修复组织HE染色和Masson染色表现

2.3各组大鼠修复组织中胶原含量比较 模型组、 组织工程组、组织工程复合鹿茸多肽组胶原含量分别为(11.292±3.194)μg/g、(14.811±2.547)μg/g、(17.013±2.098)μg/g，组织工程组、组织工程复合鹿茸多肽组胶原含量均明显高于模型组(P均<0.05)，组织工程复合鹿茸多肽组明显高于组织工程组(P<0.05)。

3 讨 论

肌腱缺损修复一直是临床的难题，过去主要采用自体肌腱移植或同种异体肌腱移植的方法修复肌腱缺损，均能取得一定疗效，但是，切取肌腱组织会造成新的损伤，供体有限和免疫排斥等因素使临床应用受到限制。1993年，科学家提出利用组织工程技术制造组织损伤修复的替代材料[13]，为肌腱损伤修复提供了新的治疗方法。利用支架材料构建组织工程肌腱能够增加力学强度，但也存在一些问题，如细胞增殖分化效率低、生物兼容性差、降解速度与修复速度不匹配等[14]。细胞片技术可以更好地保留细胞间连接和细胞生存微环境，能够用于缺损组织修复[15]。本研究体外培养大鼠肌腱细胞，利用维生素C诱导端粒酶的活性增加细胞外基质分泌[16]，构建无支架的组织工程肌腱。组织工程肌腱中细胞外基质分泌丰富，较疏松地呈纵向排列，细胞分布于细胞外基质之间。Masson染色显示组织工程肌腱中有连续的呈波浪状的胶原纤维，说明构建的组织工程肌腱具有不成熟肌腱的组织结构特点。用组织工程肌腱修复大鼠髌韧带缺损，结果显示修复组织的大体结构和组织学结构优于只做缝合处理的模型组，修复组织的胶原含量较高。说明无支架的组织工程肌腱虽然力学强度不高，但用其填补髌韧带缺损，可以帮助缺损部位尽快修复。另外，该组织工程肌腱不含任何人工合成材料，制作简单方便，具有更好的生物兼容性，用于治疗肌腱损伤修复具有一定可行性。

鹿茸多肽的药理作用广泛，已有研究者将其应用于免疫调节、冠心病、骨质疏松、神经损伤、皮肤损伤等的治疗研究[17-21]，但其用于肌腱损伤修复的报道还比较少。徐效义等[22]实验证实局部应用鹿茸多肽-PLGA复合膜能减轻肌腱术后粘连，促进肌腱愈合。王琦等[10]研究显示鹿茸多肽能促进成纤维细胞增殖和促进胶原蛋白分泌，其机制可能与激活ERK 1/2磷酸化及增加TGF-β1表达有关。本实验将组织工程肌腱复合鹿茸多肽修复大鼠髌韧带缺损，结果显示修复组织的大体结构和组织学结构优于未用鹿茸多肽处理的组织工程组和模型组，且修复组织中胶原含量更高，说明鹿茸多肽对大鼠髌韧带缺损的修复有促进作用，原因可能为促进肌腱细胞增殖和(或)促进胶原蛋白分泌。后续将进行体外实验，探索鹿茸多肽对肌腱细胞增殖及胶原蛋白分泌能力的影响及可能机制。

综上，本研究探索了无支架组织工程肌腱和中药鹿茸多肽对肌腱损伤修复的促进作用，获得了有用的生物学信息，希望对肌腱损伤修复的研究产生一定促进作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。