剪刀股中生物碱的含量测定及其体外抗氧化作用研究
2021-07-21王威孙晓丽
王威 孙晓丽
[摘要] 目的：采用酸性染料比色法测定剪刀股中总生物碱的含量并研究其抗氧化活性。方法：生物碱与酸性染料溴百里香酚蓝结合，生成有色离子对，采用二氯甲烷萃取，测定二氯甲烷中有色离子对特征波长处的吸光度，从而可计算其总生物碱含量;以维生素C为对照，测定其总抗氧化能力。结果：显色后在425 nm处有最大吸收，盐酸小檗碱与溴百里香酚蓝显色后在20-60 ?g/mL 范围内成线性关系，平均回收率为 99.12 %，RSD为 4.9 %（n=5）。当剪刀股总生物碱浓度为 0.05 mg/mL 时，测定总还原能力，吸光度值为 0.355。結论：酸性染料比色法具有良好的专属性、精密度和稳定性，操作简便，可作为剪刀股生物碱含量测定的有效方法。剪刀股中生物碱具有一定的抗氧化活性。
[关键词] 剪刀股;总生物碱;紫外可见分光光度法;酸性染料比色法;抗氧化
Determination of the Total Alkaloids of Ixeris Debilis A.Gray and Its Antioxidant Activity
WANG Wei1 SUN Xiaoli2
（1. NO.3 Hospital of Zhangjiakou， Zhangjiakou， Hebei Province， 75000 China;
2. Yi County Maternal and Child Care Hospitali， Baoding， Hebei Province， 074200 China）
Abstract： Subjective： To determine the content of total alkaloids in Ixeris Debilis A.Gray by acid dye colorimetric method and to study the antioxidant activity of total alkaloids. Method： The alkaloids were combined with the acid dye of bromothymol blue to produce the colored ion pairs. The total alkaloid content were calculated by the absorbance of the colored ion pairs， which was abstracted by Dichloromethane at the characteristic wavelength. Use Vitamin C as comparison， determine the total antioxidant capacity. Result： After color development， the maximum absorption occurred at 425 nm. The ion-pair of Berberine hydrochloride and bromothymol blue was linear in the range of 20-60 ?g/mL. The average recovery was 99.12 %， RSD=4.9 %（n=5）. When the concentration of total alkaloids was 0.05 mg/mL， the absorbance value which indicate the total reducing capacity was 0.355， Conclusion： Acid dye colorimetric method has good specificity，precision and stability， and it is easy to operate. It can be used as an effective method for the determination of total alkaloids in Ixeris Debilis A.Gray.The total alkaloids in Ixeris Debilis A.Gray had shown antioxidant activity.
Key Words： Ixeris debilis A.gray; Total alkaloid; Ultraviolet spectrophotometer; Acid dye colorimetry; Antioxidant activity
剪刀股（Ixeris debilis A.Gray）始载于《救荒本草》，别名鸭舌草、鹅公英，为菊科植物，以全草入药。民间多用其清热解毒，利尿消肿。马金萍[1]报道剪刀股醇提物对脑缺血再灌注小鼠心肌具有保护作用。蒲明秋等[2]报道剪刀股提取物可对抗烟碱引起的致癌作用。本课题组前期研究发现，剪刀股多糖具有一定降血糖作用[3]，剪刀股挥发油具有抑菌作用[4]。剪刀股总酚酸对小鼠缺血心肌具有一定保护作用[5]。但剪刀股总生物碱尚未见文献报道。本研究建立酸性染料比色法测定剪刀股总生物碱含量的方法，并测定其总抗氧化能力。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Alpha-1900型紫外可见分光光度计 （ Shanghai Lab-Spectrum Instruments Co.， Ltd）;万分之一电子分析天平（sartoriu公司）; PHS-3C 数字酸度计（SHANGHAI DAPU INSTRUMENTS CO.， LTD）; QL-901 涡旋混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 试药
剪刀股（河北省张家口市，经张家口学院韩博副教授鉴定为剪刀股 Ixeris debilis A.Gray 全草）;盐酸小檗碱对照品（南京泽朗生物科技有限公司）; 其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
将盐酸小檗碱对照品干燥至恒重。精密称取适量，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，摇匀，得浓度为 0.5000mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
取剪刀股粗粉 1.0 g，精密称定，加10%盐酸10 mL，浸泡20 min 后，超声 30 min，放冷至室温、过滤。滤渣加10%盐酸10 mL，超声 30 min，放冷至室温、过滤。合并两次滤液，10%盐酸定容至 25 mL。精密量取上述溶液 5 mL，置 10 mL 容量瓶中，10%盐酸定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液[6]。
2.3 总生物碱的含量测定
2.3.1 测定波长的选择
精密量取盐酸小檗碱对照品溶液及剪刀股供试品溶液各 2.0 mL，分别依次加入p H=6.8 的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液 10.0 mL，酸性染料溴麝香草酚蓝溶液 4.0 mL，二氯甲烷 5.0 mL，充分振摇，静置分层，分出二氯甲烷层。再分别采用二氯甲烷 5.0 mL萃取2次，合并二氯甲烷萃取液，至 25 m L 量瓶中，定容。另取二氯甲烷2.0 mL平行操作进行空白对照，对盐酸小檗碱对照品溶液、剪刀股供试品溶液及空白对照溶液于200-800nm范围进行扫描，盐酸小檗碱对照品溶液、剪刀股供试品溶液均在425 nm处有最大吸收，而空白对照溶液于425 nm处无干扰。因此以 425 nm 可为测定波长。
2.3.2 标准曲线的制备
精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液 1.0 mL、1.5 mL、2.0mL、2.5 mL、3.0mL于25mL容量瓶中。分别精密加入酸性染料溴麝香草酚蓝溶液 2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液定容。按“2.3.1 测定波长的选择”项下方法显色后测定吸光度。以盐酸小檗碱对照品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得回归方程：y=0.0134X-0.0078（r=0.9998），结果显示盐酸小檗碱在20-60 ?g/mL 的范围内线性良好。
2.3.3 精密度实验
精密量取盐酸小檗碱对照品溶液 2.0 mL，加入酸性染料酸性染料溴麝香草酚蓝溶液 4.0 mL和枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液 9 mL，按“2.3.1 測定波长的选择”项下方法显色后测定，所测结果RSD=2.26 %（n=6），显示方法精密度良好。
2.3.4 稳定性实验
精密量取剪刀股供试品溶液 2 mL，按“2.3.1 测定波长的选择”项下方法显色后测定，每隔15 min 测定吸光度，共测定9次。可见 2 h 内所测定的结果的 RSD 为 2.33 %，可知此测定方法在2h内较为稳定。
2.3.5 重复性实验
精密量取剪刀股供试品溶液 2 mL，按“2.3.1 测定波长的选择”项下方法显色后测定，结果RSD=2.28 %（n=6），显示方法重复性良好。
2.3.6 加样回收率实验
精密称定含量已知的剪刀股样品粉末五份，各1.0 g，加10%盐酸50 mL，浸泡 20 min，超声30 min，放冷至室温、过滤，滤渣加10%盐酸10 mL，超声 30 min，放冷至室温、过滤，合并两次滤液，用10%盐酸定容至 100 mL 量瓶中。精密量取 1 mL，精密加入 0.2000 mg/mL 的盐酸小檗碱对照品溶液1 mL，用10%盐酸定容至10 mL，摇匀，即得，按“2.3.1 测定波长的选择”项下方法显色后测定，结果表明，平均加样回收率为99.12%，RSD=4.9%。
2.3.7 样品含量测定
精密称取剪刀股粗粉三份，各1.0 g，按“2.2 供试品溶液的制备”项下方法制备样品溶液，并采用“2.3.1 测定波长的选择”项下方法进行吸光度显色后测定，通过标准曲线计算得总生物碱的含量。 结果见表 1。
2.4 总还原能力：参照文献[7]的方法，分别吸取适量剪刀股总生物碱提取液，配制成浓度为 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的待测溶液。分别吸取1 mL待测溶液，加入 2.5 mL pH值为 6. 6的磷酸盐缓冲溶液和 2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，摇匀。于50℃水浴中反应 20 min后取出， 加入2. 5mL 10% 的三氯乙酸， 离心 （ 3 000 r/min） 10 m in。取上清液 2. 5 mL，加入 2 mL蒸馏水和 0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液， 混匀后室温反应 10 min。以维生素C为对照，在 700 nm 处测定吸光值，结果可知，在 0.01-0.05 mg/mL的范围内，剪刀股总生物碱的总还原能力与其质量浓度间呈正相关。但与相同浓度的维生素C相比，剪刀股总生物碱的总还原能力略低。
3 讨论
具有碱性的有机含氮化合物在酸中产生正离子。酸性染料的分子可发生解离，产生负离子。以上二者通过电荷的吸引作用结合为有色络合物，而此络合物可以被氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等定量提取，并在可见光范围内某个特定的波长处有吸收。酸性染料比色法即通过测定此波长的吸光度计算总生物碱的含量[8]。
此方法是测定药用植物中总生物碱含量的重要方法。目前有多种测定药用植物中总生物碱含量的方法。此测定方法较紫外分光光度法[9]专属性强，同时避免了分离的操作;较高效液相色谱法[10]简便，价格低廉，不需要昂贵的设备;酸碱滴定法[11]也可以测定生物碱的含量，但酸碱滴定法需要操作者有熟练的操作技术，并且容易产生偶然误差。重量法[12]在萃取过程中容易损失产品，导致测定结果准确性和重现性均较差。
本实验建立的酸性染料比色法，灵敏度高，操作简便，重现性好。因此本方法较其他方法更适合于药用植物中总生物碱的含量测定。
天然物质的体外抗氧化作用的研究内容主要包括：2，2'-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸） 自由基（ABTS）[13]、超氧阴离子自由基（O2.-）[14]、1，1-二苯-1-苦基苯肼自由基（DPPH）[15]、羟基自由基（OH）[16]清除能力及总还原能力[7]的研究。其中总还原能力的研究可以较为全面的体现天然物质的抗氧化活性。所以本研究采用测定剪刀股总生物碱的总还原力的方法研究其抗氧化活性。但是体外抗氧化活性并不能完全体现天然物质作为药物的抗氧化活性，还需要进行体内抗氧化活性研究，包括天然物质对超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力、还原型谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）[17]的影响。对一种物质抗氧化能力全面评价需要结合体内外抗氧化能力综合评定，本研究进一步的研究重点放在剪刀股总生物碱的体内抗氧化作用的研究。
对剪刀股总生物碱总还原能力作用的研究表明剪刀股总生物碱提取液具有较好的抗氧化活性。本研究结果可以为剪刀股总生物碱类化合物的进一步开发利用提供理论依据。
参考文献
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