竹节参总皂苷对妊娠期高血压胎盘滋养细胞氧化应激损伤与过度自噬的影响

关 琦，张化莲*，张珊珊，秦红娟

1.驻马店市中心医院 产科，河南 驻马店 463000

2.河南省人民医院 妇产科，河南 郑州 450000

妊娠期高血压疾病（hypertension disorder complicating pregnancy，HDCP）是孕妇常见疾病之一，其发生与先兆子痫、剖宫产、脑血管疾病、胎儿生长受限、早产以及孕产妇和围产儿死亡等密切相关[1-2]。HDCP使妊娠复杂化，严重危及母婴安全[3]。HDCP病因和发病机制复杂，越来越多的研究表明，HDCP与多种因素引起的母胎代谢或免疫平衡有关，而胎盘滋养细胞作为妊娠建立和维持的基础，其功能异常后会导致胎盘形成受阻，释放大量炎性因子，使血管内皮受损，最终导致子痫前期的发生[4-5]。

竹节参Panax japonicus(T.Nees) C.A.Mey.是五加科人参属植物，竹节参总皂苷是其主要有效成分，具有镇痛、抗衰老、抗氧化、抗炎、免疫调节以及神经保护效应等作用[6-7]。竹节参总皂苷对Triton WR-1339诱导的高脂血症小鼠具有一定的调血脂作用[8]，而竹节参总皂苷在HDCP中的作用至今却未见报道。人胎盘滋养细胞株HTR-8/SVneo是一种永生化的滋养层细胞系，具有许多与人类原代滋养层细胞相似的特性，目前已成为研究胎盘功能和妊娠相关疾病的主要细胞系。本研究采用亚硝基左旋精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME）干预HTR-8/SVneo细胞模拟HDCP微环境，探讨竹节参总皂苷对HDCP胎盘滋养细胞氧化应激损伤及自噬的影响，并初步探究其作用机制，从而为HDCP的研究及诊治提供实验基础。公司；CCK-8试剂盒（批号42022ES34）和Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒（批号40302ES20）购自北京全式金生物科技公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（批号A00312）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（批号A00132）、谷胱甘肽（glutataione，GSH）检测试剂盒（批号A00512）购自南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂盒（批号15596-026）、SYBR®Premix Ex TaqTMII试剂盒（批号RR047A）购自日本Takara公司；逆转录试剂盒（批号050720190702）购自上海生工生物工程有限公司；细胞裂解液（批号P0013）、BCA蛋白定量试剂盒（批号P0010S）、PVDF膜（批号P0016S）购自上海碧云天生物技术有限公司；脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4，FABP4）抗体（批号3579S）、微管相关蛋白1轻链3-II（microtubule associated protein 1 light chain 3 II，LC3-II）抗体（批号3868S）、LC3-I抗体（批号4599S）、p62抗体（批号3534S）、自噬效应蛋白（Beclin-1）抗体（批号3495S）购自美国CST公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号TA-1203）、HRP标记的山羊抗兔抗体（批号ZB-2306）购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 仪器

1 材料

1.1 细胞

HTR-8/SV-neo细胞购自上海瑞鹿生物技术有限公司。

1.2 药品与试剂

竹节参总皂苷（质量分数为85.4%）由首都医科大学中医药学院中药化学实验室提供；L-NAME（批号1115878）购自美国Sigma公司；胎牛血清（批号2166446）、青霉素-链霉素（批号20190909）购自美国Gibco公司；DMEM/F12培养基（批号C11995500CP）购自美国Thermo Fisher Scientific

BC-J160S细胞培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；低温高速离心机（德国Heraeus公司）；MACSQuant Analyzer流式细胞仪（德国Miltenyi公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；DYY-6C电泳仪（北京六一仪器厂）；PCR扩增仪（美国ABI公司）；M340651酶标仪（北京中西远大科技有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

HTR-8/SV-neo细胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）的DMEM/F12培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，每2天换液1次，待细胞融合度达到80%～90%时进行传代，使用第3～5代细胞进行后续实验。

2.2 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞活力的影响

取处于对数生长期的HTR-8/SV-neo细胞，以4×104/mL接种至96孔板，培养12 h。设置对照组、模型组和竹节参总皂苷（20、40、80 μg/mL）[9]组，模型组和各给药组加入L-NAME（100 μmol/L）处理48 h；各给药组再加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h，加入10 μL CCK-8试剂，孵育1 h，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值。

2.3 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞凋亡的影响

按“2.2”项下方法处理细胞和分组，收集细胞，以PBS洗涤2次，加入500 μL 1×Binding Buffer重悬，加入5 μL Annexin V-FITC和PI试剂，室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞上清液中MDA、SOD和GSH的影响

按“2.2”项下方法处理细胞和分组，收集上清液，按试剂盒说明书检测细胞上清液中MDA、SOD和GSH水平。

2.5 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞FABP4、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62和Beclin-1蛋白表达的影响

按“2.2”项下方法处理细胞和分组，收集细胞，加入裂解液，10 000×g离心20 min，取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶于室温封闭2 h，分别加入FABP4、LC3-II、LC3-I、p62、Beclin-1和GAPDH抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；TBST洗涤后，加入HRP标记的山羊抗兔抗体（1∶5000），室温孵育2 h，加入ECL化学发光液，采用凝胶成像仪曝光成像，BandScan5.0软件分析条带灰度值。

2.6 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞FABP4 mRNA表达的影响

按“2.2”项下方法处理细胞和分组，收集细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：FABP4上游引物5’-AAGAGAAAACGAGAGGATGATAAAC-3’，下游 引 物5’-ATGCGAACTTCAGTCCAGGTC-3’；GAPDH上游引物5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’，下 游 引 物5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’。

2.7 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞LC3表达影响

取处于对数生长期的HTR-8/SV-neo细胞，以1×104/孔接种至24孔板内的无菌玻片上，培养12 h。按“2.2”项下方法分组，收集细胞，PBS洗涤，于4%多聚甲醛中室温固定20 min，加入0.5%TritonX-100透膜15 min，加入10%山羊血清室温封闭2 h，加入LC3抗体（1∶150），4 ℃孵育过夜；PBS洗涤，滴加Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体，室温避光孵育1 h；PBS洗涤，滴加DAPI染色10 min；PBS洗涤，封片，于荧光显微镜下观察细胞LC3表达情况。

2.8 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。数据以±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

3 结果

3.1 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞活力的影响

如图1所示，与对照组比较，模型组细胞活力显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组细胞活力显著升高（P＜0.05）。

图1 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞活力的影响(±s , n=3)Fig.1 Effect of total saponins from P.japonicus on viability of HTR-8/SV-neo cells (±s , n=3)

3.2 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞凋亡的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。

图2 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞凋亡的影响 (±s , n=3)Fig.2 Effect of total saponins from P.japonicus on apoptosis of HTR-8/SV-neo cells (±s , n=3)

3.3 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞上清液中MDA、SOD和GSH的影响

如表1所示，与对照组比较，模型组细胞上清液中SOD和GSH水平显著降低（P＜0.01），MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组细胞上清液中SOD和GSH水平显著升高（P＜0.01），MDA水平显著降低（P＜0.01）。

表1 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞上清液中MDA、SOD和GSH的影响 (±s , n=3)Table 1 Effect of total saponins from P.japonicus on levels of MDA, SOD and GSH in supernatant of HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

表1 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞上清液中MDA、SOD和GSH的影响 (±s , n=3)Table 1 Effect of total saponins from P.japonicus on levels of MDA, SOD and GSH in supernatant of HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：##P＜0.01**P ＜ 0.01 vs control group; ##P ＜ 0.01 vs model group

组别 剂量/(μg·mL-1) MDA/(μmol·L-1) SOD/(μmol·L-1) GSH/(μmol·L-1)对照 — 6.56±0.62 104.01±9.77 112.81±10.21模型 — 25.87±2.31** 54.01±5.51** 64.13±6.76**竹节参总皂苷 20 17.06±2.01## 69.81±6.49## 72.84±7.62##40 12.21±1.45## 78.60±7.33## 90.61±8.81##80 10.53±0.91## 80.41±7.92## 96.89±9.07##

3.4 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞FABP4 mRNA和蛋白表达的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组细胞FABP4mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组细胞FABP4mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。

图3 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞FABP4 mRNA (A) 和蛋白 (B) 表达的影响 (±s , n=3)Fig.3 Effect of total saponins from P.japonicus on expressions of FABP4 mRNA (A) and protein (B) in HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

3.5 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin-1蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），p62蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），竹节参总皂苷（40、80 μg/mL）组p62蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。

图4 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin-1蛋白表达的影响 (±s , n=3)Fig.4 Effect of total saponins from P.japonicus on expressions of LC3-Ⅰ, LC3-Ⅱ, p62 and Beclin-1 in HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

3.6 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞LC3表达的影响

如图5所示，对照组细胞LC3荧光染色弱，模型组细胞LC3荧光染色较强，各给药组细胞LC3荧光染色较模型组降低。

图5 竹节参总皂苷对HTR-8/SV-neo细胞LC3表达的影响 (×100)Fig.5 Effect of total saponins from P.japonicus on LC3 expression in HTR-8/SV-neo cells (× 100)

4 讨论

近年来HDCP约占妊娠的10%，尽管目前关于HDCP已开展了大量的研究，但HDCP仍然是妇产科中最棘手的难题[2]。HDCP的发病机制起源于胎盘异常，其中心环节是滋养细胞功能异常所致的胎盘生理性障碍。胎盘发挥着母体与胎儿之间营养物和氧气交换的作用，从而使胎儿能够正常生长和发育。当胎盘功能受损时，胎儿的生长受到影响，从而导致胎儿生长受限[10]。因此，胎盘滋养细胞在HDCP发病中起着关键作用。以一氧化氮合酶抑制剂L-NAME干预人胎盘滋养细胞，可以模拟HDCP的微环境，从而开展HDCP的相关研究[11-12]。本研究结果显示，经L-NAME处理后，HTR-8/SV-neo细胞活力明显降低，细胞出现大量的凋亡，表明HDCP中可能会引发胎盘滋养细胞的生物学功能异常；竹节参总皂苷能够提高HTR-8/SV-neo细胞活力，并抑制细胞的异常凋亡现象，表明竹节参总皂苷对HDCP中的胎盘滋养细胞可能发挥一定作用。

氧化剂与抗氧化剂的产生以及能力之间的不平衡会导致氧化应激反应。活性氧在组织和器官中的积累会诱发心血管疾病、神经系统并发症、癌症、呼吸系统疾病、类风湿性关节炎以及与妊娠相关疾病的发生[13-14]。与正常孕妇相比，患有HDCP的孕妇体内氧化应激反应增加。SOD和GSH具有抗氧化物酶性质，能够通过协同清除活性氧和自由基来减轻氧化性损伤；MDA是脂质过氧化产物，其含量的高低可以体现氧化反应的状态[15]。本研究结果显示，L-NAME干预后HTR-8/SV-neo细胞上清液中SOD和GSH水平降低，MDA水平升高，表明HTR-8/SV-neo细胞发生了氧化应激反应；竹节参总皂苷组细胞上清液中SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，表明氧化应激反应被抑制。

自噬是细胞内分解代谢的稳态机制，可以将细胞内组分转移至溶酶体进行降解和氨基酸循环。Beclin-1是自噬的关键调节剂，在其启动和进程中均起着重要作用，可以通过激活各种细胞信号通路调控自噬发生；存在于细胞质中的p62能够与经泛素化蛋白结合，并与LC3-II结合形成复合物，在溶酶体内发生降解。自噬是维持细胞应激反应稳态的重要机制之一，能够在早期胎盘缺氧和营养受限的环境中对滋养层细胞起到重要的保护作用，但过度的自噬可能会破坏细胞结构并诱导细胞发生异常死亡[16-17]。然而，自噬是否与妊娠相关疾病的胎盘功能障碍的病理过程有关，是否存在由于氧化应激损伤而导致滋养细胞过度自噬，以及这些过程发生的潜在机制尚待证实。本研究结果显示，经L-NAME干预后，HTR-8/SV-neo细胞LC3荧光染色增强，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平均升高，p62蛋白表达水平降低，表明HTR-8/SV-neo细胞发生过度自噬；竹节参总皂苷组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平降低，p62蛋白表达水平升高，表明竹节参总皂苷能够改善HDCP中胎盘滋养细胞的过度自噬现象。

FABPs是脂质分子伴侣的家族成员，能够通过调节几种脂质信号通路来促进系统性代谢。FABP4在细胞和组织中的异常表达与疾病的发病机制密切相关，通过特异性抑制剂、中和抗体或未知受体拮抗剂对FABP4功能的药理修饰将是针对肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化等多种疾病的新型治疗策略[18-19]。Tu等[20]通过检测妊娠期前3个月患者血浆中FABP4水平发现，妊娠早期较高的FABP4水平与妊娠期糖尿病风险增加有关。在肥胖诱发的非酒精性脂肪肝中，FABP4表达显著增加，过氧化酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）具有抑癌基因的作用，而FABP4能够促进疾病的发生[21]。本研究结果显示，经L-NAME干预后，HTR-8/SV-neo细胞中FABP4mRNA和蛋白表达水平明显升高；竹节参总皂苷显著抑制FABP4mRNA和蛋白表达水平，表明竹节参总皂苷可能通过调控FABP4表达来改善HDCP中胎盘滋养细胞损伤。

综上所述，竹节参总皂苷能够抑制L-NAME干预的胎盘滋养细胞活力降低以及细胞凋亡，并改善细胞的氧化应激损伤与过度自噬，其机制可能与调控FABP4表达有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突