海藻酸钠基pH响应性聚合物胶束的制备及释药性能研究

韩俊源 王玉珑刘庆坚 刘艳新

（长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南长沙，410114）

海藻酸钠是提取自褐藻或马尾藻的天然线性多糖，由1-4-α-L-古罗糖醛酸（G段）和1-4-β-D-甘露糖醛酸（M段）组成［1-3］。作为一种资源丰富的天然生物质材料，海藻酸钠在造纸、食品、医药等领域具有广泛的用途，如造纸行业中用作增强剂［4-6］、表面施胶剂［3，7］、涂布助剂［8］，食品行业中用作稳定剂［9］，医药行业中用作黏合剂［10-12］等。以天然多糖为原料，开发新型生物质材料，提高天然产物的应用价值，具有十分重要的意义。近年来，使用天然多聚糖制备智能型药物载体实现药物缓释或控释成为研究热点之一。pH响应性聚合物胶束是一种常用的智能型药物载体，可根据环境pH值的变化选择性地释放药物，实现药物的靶向控制释放［13-16］，有效提高药物生物利用度［17-18］，在组织工程［19-20］、药物释放［21-23］和生物传感器［24-25］等领域具有广阔的应用前景。

本研究以海藻酸钠（天然多糖）生物质为基材，采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对海藻酸钠进行改性并制备海藻酸钠基pH响应性聚合物胶束（以下简称聚合物胶束），分析了EDC/NHS改性前后海藻酸钠的红外光谱（FT-IR）及聚合物胶束临界胶束浓度（CMC）、粒径和Zeta电位；利用反溶剂重结晶法将疏水药物金雀异黄酮包裹于聚合物胶束中，并对载药聚合物胶束的包封率、载药量和pH响应性进行了研究，以期实现药物的缓释和控释。

1 实验

1.1 材料与试剂

海藻酸钠、EDC、NHS、磷酸盐（PBS）缓冲液、氢氧化钠、无水乙醇（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司；金雀异黄酮（≥98%纯度），成都埃法生物有限公司。

1.2 仪器与设备

Nano ZS90马尔文激光粒度仪，英国Malvern公司；D＆DN JY99-IIDN超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技有限公司；TGL-16G高速离心机，上海安亭科学仪器有限公司；DSM-172荧光光谱仪，上海佰赫贸易有限公司；ALPHA1型真空冷冻干燥机，德国Marin Christ公司；Nicolet iS5型傅里叶红外光谱仪，美国Thermo Fisher公司；TU-1810（PC）型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 聚合物胶束的制备

称取0.594 g绝干海藻酸钠粉末加入到100 mL去离子水中，搅拌至完全溶解，得到海藻酸钠溶液。称取0.576 g EDC粉末和0.345 g NHS粉末加入到海藻酸钠溶液中，在磁力搅拌条件下常温反应30 min。将反应液滴入到无水乙醇中以析出沉淀，采用离心机离心15 min后得到白色固体析出物，用无水乙醇重复洗涤后过滤。将析出物在真空冷冻干燥机中干燥至质量恒定（25℃），再重新溶于去离子水中以制备聚合物胶束。

1.3.2 载药聚合物胶束的制备

采用反溶剂重结晶法将金雀异黄酮包裹于聚合物胶束中。称取金雀异黄酮粉末溶于无水乙醇中，超声分散15 min，配置得到不同浓度的金雀异黄酮无水乙醇溶液。在磁力搅拌条件下，取2 mL金雀异黄酮无水乙醇溶液逐滴加入40 mL聚合物胶束溶液（5 mg/mL）中；滴加完成后，继续搅拌10 min，将溶液经0.4µm的微孔滤膜过滤，制备得到载药聚合物胶束。

1.3.3 性能分析

1.3.3.1 FT-IR分析

采用Nicolet iS5型傅里叶红外光谱仪对EDC/NHS改性前后海藻酸钠试样进行分析，扫描范围400～4000 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.3.3.2 CMC测定

采用荧光探针法测定聚合物CMC。荧光扫描激发波长为335 nm，激发狭缝为3.0 nm，发射狭缝为2.5 nm，扫描范围350～450 nm，扫描速度为8 nm/s。1.3.3.3 聚合物胶束粒径和Zeta电位测定

移取聚合物胶束样品，加入去离子水稀释至一定浓度。采用Nano ZS90马尔文激光粒度仪对不同pH值的样品进行粒径、PDI和Zeta电位的测定。

1.3.3.4 聚合物胶束的载药量和包封率测定

采用紫外分光光度法测定载药聚合物胶束溶液的吸光度。由金雀异黄酮标准曲线计算聚合物胶束中包载药物的质量，通过式（1）和式（2）计算聚合物胶束的载药量和包封率：

式中，m1为聚合物胶束中负载的药物质量（mg），m2为聚合物胶束的绝干质量（mg），m3为聚合物胶束中投入的药物质量（mg）。

1.3.4 聚合物胶束pH响应性分析

聚合物胶束的pH响应性分析通过测定其在不同pH值溶出介质中的累计溶出度的方法进行评价，具体实验步骤参考《中国药典》（2015年版）附录XC第二法（桨法）［26-29］。量取含有2 mg金雀异黄酮的载药聚合物胶束溶液，将其置入透析袋中，分别在pH值为7.4、6.8、5.0、2.0的去离子水中进行溶出实验，控制水浴温度为（37±0.5）℃，摇床转速设定为100 r/min。自透析袋置入溶出介质开始，分别在0.5、1、2、4、6、8、10 h时取样3 mL，同时补充3 mL等温新鲜介质。取出的样品经0.22µm的微孔滤膜过滤，采用紫外分光光度计在波长260 nm下，测定所得滤液中金雀异黄酮的吸光度，并由式（3）计算累计溶出度，绘制金雀异黄酮的溶出曲线。

式中，C1、C2、Cn-1和Cn分别为不同取样时间时金雀异黄酮的质量浓度（mg/mL），V1为固定的取样量（mL），V2为溶出介质的总体积（mL），m为加入的金雀异黄酮的总质量（mg）。

2 结果与讨论

2.1 EDC/NHS改性海藻酸钠的化学原理

EDC/NHS改性海藻酸钠的化学原理如图1所示。海藻酸钠含有大量的羧基基团，在水溶性碳二亚胺盐EDC的存在下，羧基基团被活化，并与EDC上的碳二亚胺键反应生成O-酰基异脲中间体，此中间体在水溶液中难以稳定存在，会与NHS迅速反应并转化成相对稳定的海藻酸钠的NHS活性酯产物，此活性酯在酸性条件下相对稳定，在中性或碱性条件下易发生断裂［30-31］。由于EDC/NHS改性的海藻酸钠聚合物含有亲水性基团（羧基）和疏水性基团（NHS活性基团酯），当达到一定浓度时，可在水中自组装形成具有核-壳结构的聚合物胶束。聚合物胶束的亲水外壳可以保持胶束体系的稳定，内核由疏水基团组成，可用于装载疏水药物。当环境pH值改变时，聚合物的化学敏感键断裂而引起聚合物胶束破裂，从而将其中的药物释放，实现了药物的缓释与控释。

2.2 FT-IR分析

海藻酸钠和EDC/NHS改性海藻酸钠的FT-IR谱图如图2所示。从图2可以看出，海藻酸钠在3340（—OH的伸缩振动）、1625和1408（COO—的反对称与对称伸缩振动）、1030 cm-1（C—O—C的伸缩振动）处均出现了特征吸收峰，Kumar等［32］在研究中也报道了相似的结果。与海藻酸钠的吸收峰相比，EDC/NHS改性海藻酸钠的FT-IR谱图在1298 cm-1处出现新的吸收峰（酯键中C＝O的吸收峰），表明有新的酯键生成。此外，改性海藻酸钠在1408和1625 cm-1处的COO—的反对称与对称伸缩振动吸收峰强度明显降低，分析认为这是由于COO—参与了反应，生成了新的基团。FT-IR谱图分析结果表明，EDC/NHS成功改性海藻酸钠，形成了海藻酸钠的NHS活性酯。

图1 EDC/NHS改性海藻酸钠的技术路线Fig.1 Schematic diagram of EDC/NHS modified sodium alginate

图2 海藻酸钠和EDC/NHS改性海藻酸钠的FT-IR谱图Fig.2 FT-IR spectra of sodium alginate and EDC/NHS modified sodium alginate

2.3 聚合物CMC

CMC可以作为表征聚合物胶束形成的关键性参数和指标［33］。本研究以芘作为荧光探针来测定聚合物的胶束化行为，聚合物胶束lgC值与芘的荧光光谱中第一峰与第三峰强度的比值（I373/I383）关系如图3所示。

图3 聚合物胶束lg C值与I373/I383关系图Fig.3 Relationship between lg C and I373/I383 value of polymer micelle

芘是一种强疏水性的芳香环化合物，而且芘具有的荧光特性主要由其所在环境的极性决定。当聚合物的浓度很低时，芘的荧光光谱中I373/I383为稳定的数值，这是因为此时的聚合物还是以单体的形式存在于水溶液中，芘在极性溶液中分散；随着聚合物浓度提高（超过CMC），水中的聚合物单体开始聚集形成胶束，疏水性的芘会向胶束的疏水内核中聚集，即开始增溶于聚合物胶束栅栏层的疏水微区中。此时，芘所在的环境由极性转变为非极性，I373/I383会发生突变，而突变的点即是形成胶束时的浓度。由图3可得到改性海藻酸钠的CMC为0.041 mg/mL，表明改性海藻酸钠在浓度高于0.041 mg/mL时可以形成胶束。

2.4 聚合物胶束粒径和Zeta电位

聚合物胶束的粒径、PDI和Zeta电位如表1所示。从表1可以看出，当聚合物胶束溶液的pH值为2.0时，其平均粒径为220.3 nm，PDI为0.38，表明聚合物胶束粒径分布均匀，Zeta电位为-38.3 mV，粒子带负电，稳定性良好。随着溶液体系pH值升高，聚合物胶束的平均粒径和PDI逐渐减小，Zeta电位（绝对值）降低。当pH值为7.4时，其平均粒径降至87.2 nm，PDI为0.19，Zeta电位为-24.9 mV，聚合物胶束体系稳定性降低。分析认为，这是由于随着溶液pH值提高，NHS活性酯键断裂，从而引起聚合物胶束破裂。

2.5 聚合物胶束的载药量和包封率

采用反溶剂重结晶法将疏水性药物金雀异黄酮包裹于聚合物胶束中，其包封率与载药量如表2所示。从表2可以看出，聚合物胶束包封率随金雀异黄酮投药量的增加而逐步降低，而载药量随之提高。当聚合物胶束与金雀异黄酮的质量比达到10∶1后，增加金雀异黄酮投药量并不能显著提高聚合物胶束的载药量，而包封率会大幅降低。分析认为，这是由于聚合物胶束的疏水性内核结构空间有限，当聚合物胶束粒子包载一定量的药物分子后，其余过量的药物分子较难克服分子间的作用力而进入聚合物胶束内核中。

表1 聚合物胶束的粒径、PDI和Zeta电位Table 1 Particle size,PDI，and Zeta potential of polymer micelle

表2 聚合物胶束包封率和载药量的分析Table 2 Analysis of encapsulation rate and drug load of polymer micelle

2.6 载药聚合物胶束pH响应性

选用聚合物胶束与金雀异黄酮质量比为10∶1制备载药聚合物胶束，通过分析载药聚合物胶束在不同pH值溶出介质中金雀异黄酮的累积溶出度来评价载药聚合物胶束的pH响应性，结果如图4所示。

图4 载药聚合物胶束在不同pH值溶出介质中的药物溶出度Fig.4 Dissolution of drug-loading polymer micelle in releasing media with different pH value

从图4可以看出，当溶出介质的pH值为2.0时，包载于聚合物胶束中的金雀异黄酮处于相对稳定状态，释放量少，2 h时的溶出度为10.3%，10 h时为18.0%；随着pH值的升高，金雀异黄酮溶出度快速增加，在pH值为6.8和7.4时，药物在2 h时的溶出度分别达到64.9%和92.9%，在10 h时溶出度分别达到75.0%和98.9%。这是由于在酸性条件下，聚合物胶束结构稳定，能较好地包载药物；在中性条件下，聚合物疏水端的pH值敏感酯基发生断裂，聚合物的两亲性被破坏而引起胶束结构崩解，从而达到药物释放的效果。以上结果表明，载药聚合物胶束具有良好的pH响应性。

3 结 论

本研究以海藻酸钠生物质为基材，采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学改性海藻酸钠并制备了海藻酸钠基pH响应性聚合物胶束（以下简称聚合物胶束），对所制得的改性海藻酸钠和聚合物胶束进行了性能表征；利用反溶剂重结晶法将疏水药物金雀异黄酮包裹于聚合物胶束中，并对载药聚合物胶束的包封率、载药量和pH响应性进行了研究，主要研究结论如下。

3.1 经EDC/NHS化学改性后，海藻酸钠可以形成NHS活性酯聚合物，该聚合物具有亲水基团（羧基）和疏水基团（NHS酯基），可在水中形成聚合物胶束，其临界胶束浓度为0.041 mg/mL。

3.2 聚合物胶束在酸性条件下较为稳定，当pH值为2.0时，其粒径为220.3 nm，Zeta电位为−38.3 mV，聚合物胶束溶液稳定性良好。当体系pH值升高至7.4（中性）时，聚合物胶束稳定性降低，粒径变小。

3.3 聚合物胶束与金雀异黄酮的质量比影响载药胶束的包封率和载药量，高的投药量有助于提升载药量，但明显降低包封率；当聚合物胶束与金雀异黄酮质量比为10∶1时，载药聚合物胶束具有较高的包封率和载药量，分别为74.4%和8.6%。

3.4 体外溶出实验表明，载药聚合物胶束具有良好的pH响应性，在pH值为2.0的溶出介质中，载药聚合物胶束相对稳定，药物溶出度小，而在pH值为6.8或7.4的溶出介质中，载药聚合物胶束大量释放药物（溶出度大），这是因为改性海藻酸钠聚合物中NHS活性酯键在酸性条件下相对稳定，但在中性条件下易断裂。该类聚合物胶束有望作为口服型肠吸收药物的载体，实现药物的控释和缓释，提高药物利用度。