凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定饲料添加剂溶菌酶二聚体的含量

张文刚 张 妤 孙冰清 姜 芹 顾 欣 黄士新* 达列亚·阿合买提

溶菌酶二聚体是以鸡蛋清溶菌酶单体为原料，将单体溶菌酶聚合为溶菌酶二聚体，分子质量约为28.8 ku。溶菌酶二聚体分子中2 个相邻分子之间的结合方式为共价键结构，其不但保留了单体溶菌酶的酶活性，而且还产生了新的免疫活性。溶菌酶二聚体通过显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬率及其吞噬指数，提高血液中性细胞的吞噬率，从而提高断奶仔猪的非特异性免疫功能。这种特性可用于改善仔猪肠道发育，促进营养物质吸收，提高断奶仔猪增重。溶菌酶二聚体作为新型的饲料添加剂产品，其二聚体比例控制在大于总含量的30%。目前，溶菌酶二聚体常用的检测方法有高效液相色谱法和电泳法，与液相方法相比，电泳法具有成本低、操作简单、重复性高等特点[1-2]。

1 材料与方法

1.1 试 剂

柠檬酸、柠檬酸三钠，均购自上海凌峰化学试剂有限公司；三氯乙酸，购自上海凌峰化学试剂有限公司；EDTA、氢氧化钠、丙酮，均购自上海凌峰化学试剂有限公司；溶菌酶二聚体对照品，纯度99.2%，溶菌酶二聚体饲料添加剂（批号为0880、0881、0882、0883），由上海艾魁英生物科技有限公司提供；4-15%Resolving Gel 小型预制胶、10×Tris/Glycine/SDS 电泳缓冲液、Dual Color Marker，均购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；上样缓冲液（自制，4×Laemmli Sample Buffer，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；β-巯基乙醇，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪 器

离心机，德国Eppendorf 公司；涡旋振荡仪，美国Talboys 公司；BIO-RAD 电泳仪、BIO-RAD 成像系统，美国BIO-RAD 公司；Mettler Toledo AL104型电子天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 试验方法

1）标准溶液及样品的制备。①标准溶液制备。精密称取溶菌酶二聚体标准品10 mg，移取纯化水1 mL 溶解制备成浓度为10 mg/mL 的标准溶液，稀释至2 mg/mL，备用。②样品制备。取180 mg 样品溶于30 mL 0.1 mol/L 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 6.6），加3 mL 0.5 mol/L EDTA，磁力搅拌至完全溶解，然后加入15 mL 3 mol/L 氯化钠溶液，继续搅拌30 min，用氢氧化钠溶液调节pH 至11.8。离心，弃上清，向沉淀中加入1 mL 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 6.6），充分震荡30 min 至沉淀复溶。转移至2 mL 离心管，加1 mL 30%三氯乙酸溶液，充分震荡离心10 min，弃上清，加1 mL 丙酮洗涤，离心弃上清，丙酮重复洗涤1 次，置于通风橱内吹干。取25 μL 上样缓冲液，加入75 μL 纯水，充分吹洗溶解，备用。

2）标准曲线。分别取标准溶液1、2、4、6、10 μL，加入5 μL 上样缓冲液，纯水补足至20 μL，终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mg/mL，充分混匀，沸水煮1 min，5 000 r/min 离心1 min。

3）上样。将预制胶放入电泳槽中，并灌入新配置的电泳缓冲液。用微量进样器分别加入Marker、溶菌酶二聚体标准溶液和试样各10 μL，电泳条件为15 mA 恒电流。

4）染色与脱色。将2 块玻璃板取出，用刀片轻轻插入凹槽玻璃的顶部与另一玻璃板之间的缝隙，轻轻向上撬，上层玻璃轻轻撬开。使用马斯亮蓝蛋白胶快速染色液进行染色，纯水脱色至背景无色后将凝胶平整放置于紫外/白光转换板上，拍照扫描条带，分析二聚体。

5）精密度试验。取批号为0880 的溶菌酶二聚体样品，按本文材料与方法1.3 中②的方法处理后进行电泳分析，连续测定6 次，连续检测3 d，计算方法的日内精密度和日间精密度。

6）实样检测。分别取上海艾魁英生物科技有限公司生产的批号为0881、0882、0883 3 批次样品，按本文材料与方法1.3 中②的方法处理后进行电泳分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线和线性方程结果

试验结果表明，溶菌酶二聚体标准溶液0.1～1.0 mg/mL 范围内具有良好的线性，其线性方程为Y=1.99×10-5X-0.0708，R2=0.9945，结果见图1。

图1 溶菌酶二聚体标准曲线及线性方程结果

2.2 精密度实验结果

试验结果显示，样品中溶菌酶二聚体的含量为32.19%～34.91%；日内相对标准偏差为1.35%～1.73%，日间相对标准偏差为1.82%，具体试验结果见表1。

表1 溶菌酶二聚体含量测定精密度试验结果%

2.3 实样检测结果

试验结果显示，批号0881、0882、0883 样品中溶菌酶二聚体的含量为31.19%～32.89%；相对偏差均低于3%，具体试验结果见表2。

表2 实际样品中溶菌酶二聚体含量测定结果%

3 结 论

图2 溶菌酶二聚体线性试验电泳图

本试验分别对SDS-PAGE 法测定溶菌酶二聚体的电泳条件、染色液选择、标准曲线以及精密度等因素进行了研究，结果发现采用15 mA 恒电流进行蛋白的浓缩分离、快速考马斯亮蓝进行蛋白胶染色，试验时间较短且溶菌酶二聚体条带较为清晰。线性试验数据表明，溶菌酶二聚体标准溶液在1.0 mg/mL 以下具有较好的线性关系。精密度实验以及实样检测均表明，SDS-PAGE 方法测定饲料添加剂溶菌酶二聚体含量具有操作简单、准确可靠等特点，适用于饲料添加剂溶菌酶二聚体质量分析。