牛m i R-504靶基因对奶牛乳房炎调控机制的预测分析

潘翠丽，汪书哲，王兴平，罗仍卓么，魏大为，蔡小艳，马云

宁夏大学农学院动物科学系，宁夏银川750021

miRNA是一类长度为22~24 nt的非编码RNA，通过与mRNA的3′UTR区结合发挥转录后调控作用。有研究表明，miR-504通过靶向不同的基因影响众多组织和细胞的增殖和迁移，从而调控多种癌症的发生，如miR-504通过靶向FOXP1抑制人神经胶质瘤细胞增殖，同时促进细胞凋亡［1］；但在口腔癌细胞中发现，miR-504靶向FOXP1可促进细胞迁移和侵袭［2］。多项研究均表明，FOXP1作为调控癌症的重要基因之一，在白血病、卵巢癌、头颈癌、肺癌、食管癌等疾病中发挥重要作用［3-7］。另有研究表明，miR-504靶向LOXL2抑制非小细胞肺癌的细胞增殖和侵袭［8］；LOXL2可能通过Wnt-β-catenin信号通路调控卵巢癌细胞活力和细胞凋亡［9］；miR-504靶向CHD1L通过PI3K／Akt／MMP信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭［10］；靶向FZD7通过Wnt-β-catenin信号通路抑制恶性胶质瘤［11］；靶向CDK6抑制下咽鳞状细胞癌细胞增殖和侵袭［12］；靶向TP53INP1抑制恶性骨瘤细胞增殖和侵袭［13］；靶向c-FLIP降低细胞活力、抑制细胞增殖和迁移，促进结肠癌细胞的凋亡和自噬的发生［14］。上述研究均表明，miR-504在人类免疫和疾病发生中发挥重要的调控作用。但目前miR-504对奶牛乳房炎的作用及其机制尚未见报道。

奶牛乳房炎是由细菌、真菌、病毒等病原微生物引起的一种最常见的奶牛疾病之一［15-16］，可导致乳汁质量降低、产奶量下降、生产性能丧失等问题，给养殖户造成严重的经济损失［17-18］。我国奶牛乳房炎的发病率一直居高不下，是奶牛养殖业重点防范疾病之一。虽然抗生素的使用对奶牛乳房炎的治疗效果较好，但常导致产奶量大幅下降，长期使用还会使微生物产生抗性，引发奶牛的蜂窝组织炎［19］；另外，还可导致抗生素在奶牛体内残留，严重威胁人类健康。miR-504在不同细胞类型和生理状态下，通过调控不同或相同的靶基因和信号通路在与免疫相关的多种疾病中发挥重要调控作用，推测miR-504可能在奶牛乳房炎的发生和调控过程中发挥重要作用。因此，本研究通过生物信息学分析技术，对牛miR-504（bta-miR-504）的候选靶基因进行预测，结合在线预测结果对其靶基因进行GO分类统计注释分析和KEGG信号通路注释分析，通过绘制调控网络分析靶基因间的蛋白互作关系，以期为miR-504参与奶牛乳房炎调控机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 m i R-504序列保守性分析 利用miRBASE（http：／／www.mirbase.org）数据库检索miR-504在不同物种中的成熟序列并进行比对，分析其在不同物种间的保守性。

1.2 b ta-m i R-504靶基因预测及筛选 应用Targetscan（http：／／www.targetscan.org／vert_72／）和miRWalk（http：／／mirwalk.umm.uni-heidelberg.de／）在线软件进行bta-miR-504靶基因预测，应用R包VennDiagram取2个预测结果的交集作为后续分析对象。

1.3 b ta-m i R-504候选靶基因的功能注释及分类统计应用DAVID（https：／／david.ncifcrf.gov／）在线分析工具对靶基因进行GO分类统计注释分析和KEGG通路注释分析，应用R包作图。

1.4 b ta-m i R-504候选靶基因的蛋白质互作分析应用STRING（https：／／string-db.org／）功能性蛋白质互作网络在线分析软件和Cytoscape软件对候选靶基因进行蛋白质互作分析。

1.5 b ta-m i R-504候选靶基因调控网络的生物信息学分析 将候选靶基因与KEGG信号通路分析结果进行重叠分析，并输入Cytoscape软件，进行bta-miR-504的互作候选靶基因参与主要的KEGG通路网络的绘制。将蛋白质互作分析结果输入Cytoscape，应用cytohubba中的MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、Bottle-Neck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness和Stress共计11种算法计算高置信度条件下的100个存在互作关系蛋白的分值，用以评价各蛋白在调控网络中的重要性，通过取交集选取11个算法中评分均位于前30%的互作蛋白，作为候选靶基因中的核心基因。

2 结果

2.1 m i R-504序列保守性分析 miR-504成熟区序列在不同物种间呈高度保守，见表1。

表1 不同物种间miR-504序列的保守性Tab.1 Conservation of miR-504 sequences in various species

2.2 b ta-m i R-504靶基因预测及筛选 通过miRWalk在线预测，共获得1 715个候选靶基因；通过Targetscan在线预测，共获得2982个候选靶基因。2个预测结果交集中共获得477个候选靶基因，将其作为后续研究对象。

2.3 b ta-m i R-504候选靶基因的G O注释及分类统计bta-miR-504候选靶基因参与的主要生物过程包括细胞内信号转导、细胞内蛋白转运和负调控MAPK活性等，主要参与神经元投射、胞质囊泡膜和细胞内部组成等细胞组分，主要分子功能是锌离子结合、转录因子活性（序列特异性DNA序列绑定）和金属离子结合等。见图1。

图1 bta-miR-504候选靶基因的GO注释及分类统计Fig.1 GOannotation and classification statistics of candidate bta-miR-504 target genes

2.4 b ta-m i R-504候选靶基因K EGG通路富集分析bta-miR-504候选靶基因显著富集于非小细胞肺癌、AMPK、Ras和内吞等与炎症类疾病发生相关的信号通路，见图2。包含靶基因最多的前5个信号通路分别为癌症、内吞、Ras、雌激素和胰岛素信号通路；参与信号通路超过5个的靶基因分别为PIK3R1、PRKACB、PDPK1、ATP1A2、ATP1B4、CREB3L2、CREB5、EGFR、TRAF6和SHC3。见图3。

图2 bta-miR-504候选靶基因KEGG通路富集分析Fig.2 KEGGpathway enrichment analysis of candidate btamiR-504 target genes

图3 bta-miR-504候选靶基因KEGG通路富集可视化结果Fig.3 KEGG pathway enrichment visualization of candidate bta-miR-504 target genes

2.5 b ta-m i R-504候选靶基因的蛋白质互作分析预测获得的477个候选靶基因中，在中等置信度条件下（互作分数>0.4）有近400个候选靶基因编码的蛋白质存在互作关系；在高置信度条件下（互作分数>0.7）有100个候选靶基因编码的蛋白质存在互作关系。选择高置信度条件绘制蛋白互作网络图，其中存在较多互作关系（互作蛋白数>10）的蛋白包括TOLLIP、RIK3R1、TRAF6、EGFR、FBXL20、FBXL18、FBXO41、FBXL12等。见图4。这些蛋白间不仅存在广泛的互作，且其编码基因参与癌症、催乳激素、雌性激素、胰岛素、NF-kappa B、AMPK、Ras、TNF及心肌细胞肾上腺激素等信号通路，见表2。

图4 bta-MiR-504候选靶基因的蛋白互作网络图Fig.4 Protein interaction network of candidate bta-miR-504 target genes

表2 bta-miR-504候选靶基因参与的主要信号通路Tab.2 Main signaling pathways of candidate bta-miR-504 target genes

2.6 b ta-m i R-504候选靶基因调控网络的生物信息学分析 将互作较多（互作蛋白数>5）的蛋白与其编码基因参与的KEGG信号通路进行重叠分析发现，TOLLIP、EGFR、PIK3R1、PPKACB、TRAF6、LPAR2、IL1R1、CBL、GAB2、S1PR2、PYGB、CX3CL1、CFTR在调控网络中处于较核心地位。蛋白互作和编码基因参与信号通路均较多的候选靶基因为PIK3R1和EGFR，其中PIK3R1主要参与Ras、AMPK、雌激素、胰岛素、甲状腺激素、催乳素、Toll样受体、丙型肝炎等信号通路，EGFR主要参与癌症、内吞、Ras、雌激素、丙型肝炎、非小细胞肺癌和背腹轴形成等信号通路。见图5。

图5 bta-miR-504候选靶基因参与主要的KEGG通路网络Fig.5 KEGG pathway network of candidate bta-miR-504 target genes

2.7 b ta-m i R-504候选靶基因调控网络中的核心基因分析 TRAF6和CFTR在11种算法中均位于前30%，见图6。因此将二者确定为候选靶基因调控网络中的核心基因，参与AMPK、Ras、Hepatitis C和Measles信号通路调控。

图6 bta-miR-504的核心候选靶基因Fig.6 Candidate core target genes of bta-miR-504

3 讨论

有文献表明，miR-504在乳腺癌、非小细胞肺癌、口腔癌、白血病、卵巢癌、头颈癌、肺癌、食管癌等多种疾病的发生发展中发挥重要作用［2-14］，推测miR-504可调控奶牛乳房炎等免疫疾病的发生和发展，但尚无miR-504参与奶牛乳房炎调控的相关报道。同时，miR-504预测的靶基因数量庞大，涉及的信号通路众多，探讨各靶基因和信号通路间的关系需耗费大量人力和财力。本研究通过比对不同物种miR-504成熟序列的同源性，发现物种间存在高度保守性，推测miR-504在生命活动中发挥重要作用。通过DAVID软件对预测的靶基因集合进行GO和KEGG信号通路富集分析，发现这些靶基因在生物学过程层面上显著富集细胞内信号转导、细胞内蛋白转运和负调控MAPK活性等条目。KEGG信号通路富集分析发现，靶基因主要显著富集在与Ras、AMPK和内吞作用等免疫过程相关通路中，这与在人类的研究结果相似［2-14］，证明靶基因预测的准确性。

本研究通过对miR-504靶基因调控网络分析确定了TRAF6和CFTR 2个核心靶基因，TRAF6作为一个内源免疫应答基因在人类前列腺癌［20］、恶性胶质瘤［21］、结肠癌［22-23］、口腔癌［24］等疾病的调控中发挥重要作用。在小鼠乳腺上皮细胞中，姜黄素通过抑制TLR2介导的NF-κB信号通路下调TRAF6、TNF-α、IL-6、IL-1β和MEKK1的表达改善葡萄球菌引起的乳腺炎［24］。在奶牛乳腺上皮细胞中，miR-146a通过靶向TRAF6抑制NF-κB信号通路调节牛乳腺上皮细胞的炎性细胞因子抑制乳房炎的发生［25］。TLR作为牛乳腺上皮细胞的重要受体能够启动天然免疫反应，通过LPS-TLR4信号通路下调炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及下游信号分子TRAF6、IRAK1、IRAK4的表达发挥抗炎作用［26］。CFTR是一种重要的氯离子通道蛋白，控制氯离子的跨膜流动以维持细胞的正常功能，CFTR的突变通常会引起囊性纤维化病变［27-29］。KEGG信号通路分析发现，CFTR参与AMPK和醛固酮调节的离子重吸收信号通路，TRAF6参与Ras、Hepatitis C和Measles信号通路，这些信号通路均与免疫过程相关，推测miR-504通过靶向TRAF6和CFTR等关键基因参与奶牛乳房炎等免疫相关疾病的调控。

综上所述，bta-miR-504的成熟区序列在物种间高度保守，其核心候选靶基因TRAF6和CFTR可能通过AMPK、Ras、Hepatitis C和Measles信号通路参与免疫过程的调控。本实验为miR-504在奶牛乳房炎等疾病调控中作用的研究奠定了基础。