黄秋葵多糖的超声法提取及体外抗氧化活性研究

韩秋菊，王晨，陈旺，李薇

(辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001)

黄秋葵(Abelmoschusesculentus)，也称咖啡黄葵，属锦葵科黄秋葵属,富含多糖、蛋白质、不饱和脂肪酸、多种维生素、黄酮类化合物等，具有很高的开发潜力与开发价值[1]。黄秋葵多糖具有抗疲劳、抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、抗菌、提高免疫力等药理作用[2-4]，并已广泛用于面制品、肉制品、饮料、冰淇淋等食品的生产中。

超声处理工艺具有提取时间短、无腐蚀性溶剂、多糖得率高等优点，是一种绿色、环保的工艺。本研究优化了超声提取法提取黄秋葵多糖的工艺，并检测所得粗多糖的体外抗氧化活性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

苯酚、葡萄糖、浓硫酸、无水乙醇、乙醚、盐酸、三羟基氨基甲烷、抗坏血酸(VC)、邻苯三酚、水杨酸钠、过氧化氢、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯化铁、铁氰化钾均为分析纯;黄秋葵,购于农贸市场。

ALC-1100.2电子天平;TDL-40B台式离心机;DUG-9021A电热恒温干燥箱;UV-2600可见分光光度计;HH-4数显恒温水浴锅;SHB-II型循环水式多用真空泵。

1.2 黄秋葵多糖的提取

将黄秋葵的新鲜荚果清洗干净，于80 ℃烘干至恒重，充分粉碎，过0.5 mm筛，用80%乙醇溶液在80 ℃回流脱脂6 h，过滤、干燥，得黄秋葵粉末。称取黄秋葵粉末，按照一定液料比45∶1 mL/g加蒸馏水，混匀后超声处理，再水浴浸提2 h，过滤，滤液加入3倍体积无水乙醇，离心，得到粗多糖沉淀，乙醚和无水乙醇交替洗涤3次，阴凉处干燥，得黄秋葵粗多糖样品。多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[5]。葡萄糖标准曲线y=12.037x+ 0.046 1(R2=0.999 2)。

黄秋葵多糖提取率(%)=粗多糖质量(mg)×稀释倍数×100/黄秋葵样品质量(mg)

1.3 黄秋葵多糖体外抗氧化活性的测定

清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100

(1)

1.3.2 对羟基自由基(·OH)清除效果的测定 分别取10 mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、样品各1 mL，混匀，于37 ℃反应30 min， 加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液终止反应，510 nm处测吸光值Ai。A0为用H2O作空白对照的空白组吸光值。Ai0为不加H2O2的本底吸光值。清除率计算根据公式(2)。

清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100

(2)

1.3.3 总还原力的测定 取2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液、2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液和2 mL样品，混匀，于50 ℃保温30 min，加入2.5 mL H2O和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混匀，700 nm处测吸光值Ai。A0为用H2O作空白对照的空白组吸光值。总还原力计算根据公式(3)。

总还原力=Ai-A0

(3)

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

分别考察液料比、超声时间、提取温度、超声功率对黄秋葵多糖提取率的影响,结果见图1。

图1 单因素实验考察黄秋葵多糖的提取条件Fig.1 Single factor experiment to investigate the extraction conditions of Abelmoschus esculentus polysaccharide

由图1可知，最佳液料比40∶1 mL/g左右，最佳超声时间为15 min，最佳提取温度为60 ℃，最佳超声功率345 W。

2.2 黄秋葵多糖提取条件的优化

2.2.1 响应面实验结果 依据上述单因素实验结果，设计4因素3水平的Box-Behnken响应面实验,优化提取黄秋葵多糖的工艺条件。因素与水平见表1，结果见表2。

表1 Box-Behnken实验条件Table 1 Box-Behnken test conditions

表2 Box-Behnken实验结果Table 2 Results of Box-Behnken test

黄秋葵多糖提取率与各因素之间的关系可以表示为以下多元二次回归方程：

Y=6.24+0.60A+0.32B-0.17C+0.12D

+0.077AB-0.052AC+0.12AD+0.19BC

+0.65BD+0.47CD-0.26A2-0.69B2

-0.45C2-0.58D2

方程方差分析结果见表3。

表3 Box-Behnken实验方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken test

2.2.2 响应曲面图分析 图2表示任意2个因素交互作用对黄秋葵多糖提取率的影响，其余2个因素取0。交互项DB、CD的响应面图走势较陡，影响显著。此结果与P值分析结果一致。

2.2.3 验证实验 通过回归方程和响应面图分析，超声法提取黄秋葵多糖的最佳工艺条件为：液料比45.12∶1 mL/g，超声功率394.68 W，提取温度62.33 ℃， 超声时间18.16 min，预测最大提取率可达6.76%。考虑到实际操作的可行性，上述条件修正为：液料比45∶1 mL/g，超声功率395 W，提取温度62 ℃，超声时间18 min。在此条件下进行3次平行验证，黄秋葵多糖提取率分别为6.89%,6.92%,7.01%，黄秋葵多糖提取率为(6.94±0.062 4)%。实验值与预测值接近，说明该模型的可靠性较好。

2.3 体外抗氧化活性实验

体外抗氧化实验选取VC为参照。图3(a，b)为黄秋葵多糖清除超氧阴离子自由基(·O2-)和羟基自由基(·OH)的实验结果。

图3 黄秋葵多糖体外抗氧化实验结果Fig.3 Antioxidative effect of Abelmoschus esculentus polysaccharide in vitro

由图3可知,黄秋葵多糖对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除效果均与浓度正相关，具有较明显的量效关系。清除超氧阴离子自由基的IC50值为2 690.8 μg/mL，清除羟基自由基的IC50值为1 999.8 μg/mL。 黄秋葵多糖总还原力检测结果见图3(c)，由图可知，黄秋葵多糖对Fe3+有一定的还原能力，相同浓度下的还原能力低于VC，作用效果与浓度正相关。总之，黄秋葵多糖具有一定的体外抗氧化能力。

3 结论

本研究优化了超声法提取黄秋葵多糖的工艺，多糖得率达到(6.94±0.062 4)%。所得黄秋葵多糖能较好地清除超氧阴离子自由基和羟基自由基，对Fe3+有较好的还原能力，具有一定的体外抗氧化活性。