马铃薯黑胫病离体叶柄接种方法的应用效果分析

苏玉静 张乐乐 杨正威 陈红旭 刘帅 杨世玮 申顺善 孙凯乐 孙治强

摘 要：利用马铃薯离体叶柄接种方法分别比较了5种不同接种浓度、4个不同接种时间的接种效果的差异，并利用该方法鉴定了14份马铃薯品种对黑胫病的抗性。在试验中发现，使用马铃薯黑胫病菌浓度为103 CFU·mL-1，并且在接种马铃薯离体叶柄后36 h记录统计的接种效果较好。同时，利用该方法对14份马铃薯品种进行接种鉴定，鉴定出高抗品种2份、中抗品种5份、中感品种3份、高感品种4份，并且与传统主茎注射接种方法进行了比较，发现2种方法的抗性鉴定结果相近。因此利用离体叶柄接种方法鉴定出的马铃薯品种的抗性可为今后马铃薯黑胫病抗性育种提供一定的理论支持。

关键词：马铃薯;黑胫病;离体叶柄接种;抗病鉴定

中图分类号：S532 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）05-093-08

Inoculation method of potato black leg using the detached petiole

SU Yujing 1， ZHANG Lele1， YANG Zhengwei1， CHEN Hongxu1， LIU Shuai 1， YANG Shiwei1， SHEN Shunshan2， SUN Kaile1， SUN Zhiqiang1

（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to find a simple and repeatable inoculation method for potato black leg， five inoculation concentrations and four inoculation time points were tested by using the detached potato petioles. And then， 14 potato varieties were identified by using this method. The inoculated concentration with setting as 103 CFU·mL-1 and the infected petioles scored at 36 hour post inoculation （hpi） showed the stable infection results. 14 potato varieties were inoculated and identified the resistance by using this method. Also， it compared with the injection method using stem. The results shown that 14 potato varieties were distinguished into four groups： the resistance （2 varieties）， the medium resistance （5 varieties）， the medium susceptibility （3 varieties）， and the susceptibility （4 varieties）. In conclusion， the inoculation method using the detached petiole can be applied in  potato resistance breeding of black leg.

Key words： Potato; Potato black leg; Detached petiole inoculation; Resistance identification

馬铃薯（Solanum tuberosum L.）营养丰富，是世界上广泛种植的块茎作物，也是仅次于小麦、水稻和玉米种植面积和总产量的第四大粮食作物[1]。根据联合国粮农组织数据，全球马铃薯产量和种植面积分别在2014年和2015年达到最大值，之后每年的产量一直保持在4.5亿t以上，种植面积一直保持在2.4×107 hm2左右[2]。但马铃薯的生产过程受到一系列病害的威胁，其中黑胫病是危害马铃薯生产的破坏性病害之一，在我国的病害发生面积总体呈上升趋势[3]。黑胫病作为温带地区对马铃薯造成严重损害的重要细菌性病害之一，病株率的平均水平为3%～5%，严重时可达50%[4]。引起黑胫病最常见的细菌种类是果胶杆菌属Pectobacterium，包括Pectobacterium carotovora subsp. carotovora （Pcc）（原称Erwinia carotovora subsp. carotovora）;P. atrosepticum（Pca）（原称 E. carotovora subsp. atroseptica） [5-8]。该病菌主要通过维管束组织侵染马铃薯的块茎和地上茎部，在马铃薯整个生长发育阶段都可发病[9]，发病症状主要表现为植株矮化，叶片卷曲萎焉、黄化脱落，茎部组织发黑，块茎腐烂[10]。该病菌的主要传播方式是借助带病种薯通过土壤、灌溉水、昆虫等传播途径传染给其他有伤口的健康种薯，并且在高温高湿条件下会大大增加发病概率[11]。

黑胫病菌入侵马铃薯的机制主要是产生多种细胞壁降解酶，包括果胶酶、纤维素酶、蛋白酶和木聚糖酶，尤其是果胶酶分解果胶物质，释放出营养物质供病菌生活，使植物组织腐烂变软，由于腐烂组织的高渗透压，水分从细胞扩散到细胞间隙，导致细胞质壁分离、塌陷和死亡[12-13]。细菌在细胞间隙移动并繁殖，产生的酶会提前进入细胞为入侵组织做好准备[14]。此外，还有其他致病因子的协助入侵，包括胞外水解酶、脂多糖、碳青霉烯抗生素等，并通过一系列的分泌系统来分泌这些致病因子[15-23]。黑胫病菌还存在着依靠群体密度的群体感应（Quorum sensing，QS）调控系统，利用可自由扩散的化学信号分子，在病菌入侵植物时发挥着重要作用[24]。

目前针对马铃薯黑胫病的防治方法除了农业栽培管理防治措施和化学防治措施以外，利用抗病品种也是防治细菌病害最重要的措施。尽管不同马铃薯品种对黑胫病菌的易感性各不相同，但目前还没有一个已知品种对该病菌存在完全抗性[25]。虽然有些栽培种如Karaka和Dawn，以及来自中美洲和南美洲的野生马铃薯品种，对黑胫病菌表现出良好的抗性，但这些野生二倍体马铃薯品种和四倍体马铃薯品种的杂交后代表现出产量低、块茎中存在对人体和动物有毒的生物碱糖苷等缺点[26-28]。除此之外，阻碍马铃薯黑胫病抗性育种的一个重要问题是在目前的抗性材料筛选过程中筛选黑胫病抗性品系比较困难，在筛选过程中没有具体的指导方针，缺乏一种普遍接受的接种和鉴定方法。当使用不同的筛查方法时，病害的严重程度可能会大不相同。目前常用的接种鉴定方式有如下几种，宋扬等[29-30]对健康块茎进行穿刺后注入菌悬浮液，待5 d或者7 d后调查病情，这种方式的局限性在于需要等马铃薯整个种植收获期结束才能获得试验薯块;其次还存在接种之后的薯块无法再食用造成的资源浪费以及病情调查鉴定时间久等问题。除此以外，还有Mohan[31]使用的主茎注射接种鉴定法，该方法选取植株（约4周龄）第2片完全展开的真叶连接的茎部进行穿刺注射菌悬浮液，等待10 d左右调查病情;Marquez-Villavicencio[32]对生长4周龄植株的茎部每隔3 cm的5个不同位置进行穿刺注射菌悬浮液后，将接种的植株放入塑料袋等待13.5 h进行相关试验研究。这2种注射或穿刺接种的方式会将病菌带入土壤造成污染，植株也会由于病菌侵染而无法继续生长。综上，目前对马铃薯黑胫病接种鉴定方式存在着接种过程时间较长、资源浪费、污染土壤等问题。本研究的目的是开发一种稳定、快捷评价马铃薯黑胫病抗性的简单可重复的离体叶柄接种方法。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病菌及培养基：病原菌菌株P. carotovorum subsp. brasiliense strain 212由河南农业大学植物保护学院提供。14个供试马铃薯品种为河南农业大学园艺学院茄科抗病种质创新研究团队收集并保存，材料名称、来源及类型见表1。

病菌培养所用的培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA），制备病菌悬浮液（简称“菌悬液”）的MES溶液组成为MES 2.13 g，MS 4.3 g，无菌水1000 mL，pH 5.8。接种工具及测定仪器：接种菌悬浮液倒入60 mm×60 mm×90 mm的方形透明组培瓶，离体叶柄插入长度5.8 cm、厚度0.5 cm的正方形干燥花泥（Oasis）中，发病高度用刻度尺测量。

1.2 试验设计

将14个不同的马铃薯品种的块茎进行赤霉素浸种催芽，整薯催芽用10～20 mg·kg-1赤霉素溶液浸泡20 min ，浸泡捞出后堆积在阴凉处，使用经过500倍甲基硫菌灵溶液浸泡的刀具切薯，每块种薯大概25 g，保留2个芽眼，以30 kg为一堆，覆盖沙子与草席保温，8 d后检查薯堆，选取芽长2 cm的薯块种植在河南农业大学科教园区的日光温室内，每种试验品种种植100个块茎种薯，随机区组排列，每个小区种植面积为31.86 m2，每小区5垄，垄宽0.75 m，垄长8.5 m，每垄20株，株距40 cm，3次重复。试验材料分别于2019年8月15日、2020年1月23日、2020年8月25日种植。试验按照田间常规管理，及时培土除草，各小区间水肥管理一致。

1.3 方法

1.3.1 病原菌培养以及病菌悬浮液制备 将纯化后的病菌单菌落在TSA培養基上全皿划线28 ℃暗培养36 h。用9 mL MES溶液洗涤培养36 h的平板上的菌体，混合均匀后用分光光度计测定菌悬液的OD600值判断菌悬浮液的浓度，用MES溶液对上述菌悬液进行稀释直至试验所需浓度。

1.3.2 马铃薯离体叶柄的接种 选取有10片完全展开叶的马铃薯植株（约幼苗出土后35 d）的第4片到第6片叶的叶柄，将相同马铃薯品种的叶柄统一切割成6.5 cm高度，并将处理好的叶柄插入长度5.8 cm、厚度0.5 cm的正方形干燥花泥中，每个花泥上插有5～8段同一试验品种的叶柄;在60 mm×60 mm×90 mm的方形组培瓶里分别倒入40 mL试验所需浓度的MES稀释菌悬液，空白对照组的组培瓶中倒入40 mL的不含菌液的MES溶液，将插有叶柄的花泥放入方形组培瓶，盖上组培盖。将组培瓶放入25 ℃、16 h/8 h（光/暗）的光照培养箱进行培养观察。试验设置6瓶生物学重复。

1.3.3 马铃薯主茎注射接种 依照Mohan使用的主茎注射接种鉴定法，选取植株（生长约4周龄）第2片完全展开的真叶连接的茎部，用一次性无菌注射器针头穿刺，用移液枪配合灭菌的枪头吸取10 ?L浓度为108 CFU·mL-1（OD600=0.89）的MES稀释菌液，接种于穿刺部位，每株马铃薯主茎在5个不同的位点接种，间距约为3 cm;接种后将接种部位覆盖保鲜膜12 h保持湿度（覆盖保鲜膜可以稳定发病率），空白对照组的植株穿刺后接种所用的为10 ?L的MES溶液[31]。

1.4 病情调查

1.4.1 离体叶柄接种病情调查 接种之后在固定时间，观察叶柄软化腐烂情况（图1-A），用刻度尺测量发病高度（图1-B）并拍照记录。对接种36 h的发病高度按分级标准（图1）进行分级并计算病情指数，最后依据计算的病情指数来确定抗性水平。病害等级根据（表2）的标准确定。

病情指数计算公式如下：

[         病情指数=∑（各级感病叶柄数×相应级数）调查叶柄数×最高级数]。

根据以下病情指数来确定马铃薯抗性水平： R（0.2≤病情指数<0.4）;MR（0.4<病情指数≤0.6）;MS（0.6<病情指数≤0.8）;S（病情指数>0.8）。

1.4.2 主茎注射接种病情调查 14 d后将马铃薯植株接病位置纵切，观察植物组织坏死范围，超过2 cm为感病材料（Susceptibility），低于1 cm为抗病材料（Resistance），组织坏死范围介于1～2 cm之间为部分抗性材料（Partially resistance）[31]。

1.5 实时荧光定量PCR验证

使用黑胫病病菌特异性引物（Y1：5-GAATATCAATAGCACTATCCTCAG-3，Y2：5-CACATTATCAACCAACAGAACC-3）与马铃薯内参引物StEFIα （F：5-ATTGGAAATGGATATGCTCCA -3，R： 5-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3）对接种后同一时间（36 h）不同病情指数的马铃薯叶柄，按每个品种随机选取3瓶叶柄，利用CTAB法提取DNA后进行实时荧光定量PCR（Quantitive Real-Time PCR，qPCR）检测黑胫病菌含量[33-35]。Q-PCR数据分析采用2-ΔΔCt法，样品数据来自3次重复试验，设定3次技术重复。

1.6 数据分析

采用SPSS 24.0统计分析软件，应用单因素ANOVA进行处理间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 马铃薯黑胫病菌浓度的确定

为了方便确定试验所使用的菌悬液浓度，利用分光光度计测定菌悬液的OD600值，用9 mL MES溶液洗涤培养36 h的平板上的菌体，混合均匀后吸取100 ?L菌液均匀涂布在TSA平板上，28 ℃暗培养12 h后计算平板上的菌落数（图2），并用分光光度计测定此时菌悬液的OD600值，则可以得到此时菌液浓度所对应的OD600值;继续用MES溶液对上述菌液进行10倍的梯度稀释，并测出相应的OD600，以此类推（表3）。

2.2 接种浓度对接种效果的影响

为了得到最适宜的接种病菌浓度，将病菌用MES溶液进行了梯度稀释，终浓度分别为10、102、103、104和105 CFU·mL-1。选用马铃薯品种Désirée进行离体叶柄接种，每隔2 h测量叶柄的发病高度并记录。从图3可以看出，发病速率与接种浓度成正比，接种浓度越高，发病速率越快。当接种浓度为105 CFU·mL-1时，在40 hpi（hour post inoculation）叶柄发病高度已高于4 cm，属于发病最高级4级，在整个发病进程中，接种浓度105 CFU·mL-1发病速率太快，不适合作为筛选不同品种抗性的浓度;当接种浓度选择10 CFU·mL-1时，在72 hpi时，叶柄的发病高度未达到1 cm，发病进程缓慢，离体叶柄长时间在液体中浸泡会造成植物免疫力下降，难以分辨叶柄是由于病原菌侵染还是长时间浸泡所导致的腐烂变软。当接种浓度选择102、104 CFU·mL-1时，在整个接种进程中叶柄发病高度数据误差较大（图3）。当接种浓度为103 CFU·mL-1时，叶柄发病高度的数据误差较小，叶柄发病高度缓慢上升，在70 hpi达到了4级的发病高度，可作为筛选不同品种抗性的适宜浓度。

2.3 处理时间对接种效果的影响

为了确定病害评价鉴定合适的时间点，用MES溶液将病菌稀释为103 CFU·mL-1，分别对马铃薯品种Désirée、Nicola、法阿利塔、荷15、威芋7号进行离体叶柄接种，并选择12、24、36、48 hpi 4个时间点进行观察，测量叶柄发病高度并记录。从图4可以看出，在12 hpi和24 hpi，Désirée、Nicola、法阿利塔、荷15、威芋7號均没有出现腐烂变软的症状，在36 hpi时不同品种之间叶柄发病高度呈现出显著性差异，不同品种的叶柄发病高度在病害等级分级中的级别分布也不相同，病害等级覆盖了1～4级。从图4可以看出，48 hpi时Désirée、Nicola、荷15、威芋7号这4个品种之间没有显著差异，并且此时5个品种的发病高度均达到了病害等级分级中的最高级别4级。结果表明，选择在36 hpi时进行叶柄发病高度的相关观察统计，可以作为确定不同品种抗性标准的时间点。

2.4 不同马铃薯品种的接种效果

为了验证在本试验中所用接种方法的可靠性，选取14个不同品种的马铃薯（Désirée、豫马铃薯1号、中薯2号、中薯3号、中薯8号、克新3号、克新4号、威芋7号、大西洋、夏波蒂、 Nicola、法阿利塔、荷15、Bintje）进行离体叶柄接种鉴定。接种浓度选取103 CFU·mL-1，测量36 hpi叶柄发病高度，按照分级标准（图1）进行分级并计算病情指数，最后根据病情指数来确定品种的抗性。14个马铃薯材品种的黑胫病抗性评价结果如表4所示，高感品种有中薯8号、大西洋、法阿利塔、Bintje;中感品种有中薯2号、夏波蒂、Désirée;中抗品种有豫马铃薯1号、中薯3号、克新3号、威芋7号、Nicola;高抗品种有克新4号、荷15。14份马铃薯品种表现出了不同的抗性，表明在本试验中采用的接种方法可以鉴别出不同品种的抗性。

2.5 不同马铃薯抗性品种黑胫病菌qPCR检测

为了验证利用该接种方法接种鉴定的14份马铃薯品种表现出的抗性与植株中的病菌含量是否相关，分别以14份马铃薯品种接种36 hpi提取的DNA为模板，以Y1/Y2为引物进行实时荧光定量PCR检测黑胫病菌含量，数据处理以Désirée作为对照。从图5可以看出，中薯8号、大西洋、法阿利塔、Bintje的病菌相对含量最高;Désirée、中薯2号、夏波蒂的病菌含量次之;豫马铃薯1号、中薯3号、克新3号、威芋7号、Nicola的病菌含量居第三;克新4号、荷15的病菌含量最低。这与鉴定得到的抗性结果一致，说明了该接种方法具有一定的可靠性。

2.6 离体叶柄接种法与田间主茎注射接种法的比较

对14个马铃薯品种采用田间主茎注射鉴定法进行了接种鉴定，并将鉴定结果与离体叶柄接种鉴定法进行了对比。从表5可以看出，14个马铃薯品种中，利用离体叶柄接种法鉴定出的S和R材料在主茎注射鉴定法中分别符合感病和抗病的发病症状，证明了离体叶柄接种法的准确性。与此同时，利用离体叶柄接种法鉴定出的MR、MS材料在主茎注射鉴定法中都归类到了部分抗性之中。

3 讨论与结论

种质资源的抗病性筛选是抗病育种工作的重要部分，因此选取一种稳定准确有效的接种马铃薯黑胫病的方法十分重要。研究认为黑胫病菌是通过传播媒介对有伤口的茎和块茎进行侵染，因而国内外有关黑胫病的接种大多是通过马铃薯块茎和主茎注射病菌进行研究[29-32]。但考虑到马铃薯黑胫病可以通过侵染维管束组织感染马铃薯植株的多个部位[12，36-37]，笔者采用了马铃薯离体叶柄接种黑胫病的方法，结果表明，接种浓度选择103 CFU·mL-1，并且在36 hpi时进行观察测量发病高度，可以获得稳定的发病效果，并可区别不同马铃薯品种间的抗性差异。

病菌可以通过细胞间的交流机制来感知它们的种群密度，在这种机制中，只有当病菌密度达到阈值时，特定的基因才会表达[38]。细胞之间的通信是通过小的、可扩散的信号分子进行的，而在革兰氏阴性菌中，它主要是由AHLs（酰基高丝氨酸内酯）介导的[39]。AHLs可以调节果胶杆菌的致病基因表达，保证了只有当病菌密度大到足以攻破植物的防御反应时，侵染才会开始[40-41]。在研究不同接种浓度对接种效果影响的试验中，发现病菌侵染叶柄需要一定时间的潜伏期，接种浓度越低潜伏期越长，当接种浓度为10 CFU·mL-1时，潜伏期达到了58 h;当接种浓度高达105 CFU·mL-1，潜伏期缩短到只有24 h，这种情况也表明了病菌浓度越高发病速度越快[42]。笔者选用了5种不同的病菌浓度进行接种测试，避免了因浓度过高或过低导致不准确的接种结果，结果表明，只有选择合适的浓度进行接种鉴定，才能获得稳定可靠的接种结果。

马铃薯对黑胫病菌的抗性除了与自身抗性机制有关以外，还与接种的时间长短有关。接种时间过短，品种的抗性差异不能体现出来;接种时间过长，抗病品种也会表现出感病症状。这主要是QS所致。QS作为种群密度依赖的调控机制，可以利用自由扩散的化学信号分子控制病菌对植物的感染[24]。病菌主要通过协调生产各种植物细胞壁降解酶来致病，研究表明QS调控细胞壁降解酶[43]。病菌刚进入植物内不能产生足量的细胞壁降解酶使组织降解变软，病菌只有在足够的时间内产生大量细胞壁降解酶，才能降解植物组织。在本试验中笔者也发现在24 hpi时，5个试验品种都未发病，不同品種的抗性差异未能体现出来，可能就是由于时间短病菌还未产生足量的细胞壁降解酶使组织降解死亡;而在48 hpi时，5个品种都达到了最大发病等级，说明病菌产生的大量细胞壁降解酶也使抗病品种受到威胁，很显然这2种处理时间都不能作为筛选品种抗性的接种时间;本研究的结果表明，36 hpi时可以观察到不同品种有不同的发病等级，猜测是由于合适的时间积累，病菌产生的细胞壁降解酶可使感病品种死亡但又不致于威胁到抗病品种的生命。

离体叶柄接种法与田间主茎注射接种法的比较结果表明，2种方法的发病情况基本一致，但由于田间主茎注射接种法的材料存在鉴定周期长的问题，在抗病鉴定过程中也会出现肉眼难以观察的腐烂症状或者发病不稳定的情况，从而导致无法定性定级，最终造成分析结果不准确。

由于马铃薯黑胫病是马铃薯栽培过程中的普遍性病害，西方国家很早就开展了马铃薯黑胫病抗性研究，而我国对该病的研究起步较晚、进程较慢，因此应该注重抗性品种的鉴定筛选。

综上，笔者在本试验中探索的马铃薯离体叶柄接种法即接种浓度选择103 CFU·mL-1，并且在36 hpi时进行观察测量发病高度，可以用来鉴定评估马铃薯对黑胫病的抗性。用离体马铃薯叶柄接种法评估了14个马铃薯品种对黑胫病的抗性，鉴定周期短且不浪费马铃薯块茎，对马铃薯抗黑胫病生产具有实际的指导意义。

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