第十届中国花博会中烟草脆裂病毒生物学特性及检测监控技术应用

田沂民 朱雅君 印丽萍 陈仲兵 滕 凯 于 翠

第十届中国花博会于2021年5月21日-7月2日在上海崇明岛举办。其中从国内外大规模输入新品种植物种球、种苗、种子、种植介质及木质包装品。这些植物及其相关产品很可能会携带大量外来生物，使得崇明岛的生态安全遭受重大威胁。病毒是迄今为止人们在超微世界里所认知的最小生物之一，其随植物传播扩散更为隐秘，这严峻考验着防控能力。其中烟草脆裂病毒是一种能侵染多种花卉植物的植物病毒，通过寄主植物繁殖材料（种球、砧木、芽条等）的贸易活动进行远距离病毒传播，或借助带毒介体线虫进行短距离扩散，为阿根廷、巴西、加拿大、墨西哥、土耳其等国家的检疫性有害生物，在我国局部地区有发生。本次花博会大面积布置的百合、芍药、玉簪等都是其主要寄主，一旦传入可引起严重生态影响和经济损失。研究从烟草脆裂病毒的寄主范围、危害症状、传播扩散途径等生物学特性及经济影响、检测监控技术应用等方面进行阐述，为防止其再次入侵和进一步传播扩散提供参考，为花博会生态安全提供技术保障。

第十届中国花博会；烟草脆裂病毒；生物学特性；检测监控技术

烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）为杆状病毒科（Virgaviridae）烟草脆裂病毒属（Tobraviruses）典型成员，可在花卉、蔬菜等经济作物上引起严重经济损失。TRV是阿根廷、巴西、加拿大、墨西哥、土耳其等国家的检疫性有害生物。该病毒寄主范围十分广泛，可侵染超过50个科400种植物，在欧洲、北美、新西兰、俄罗斯、日本40多个国家已经发生和报道，在我国福建、河北、江苏、云南等地的牡丹、水仙、菠菜、辣椒、马铃薯等作物上有发生报道[1-6]。

中国花博会是我国花卉领域规格最高、影响最广的综合性花事盛会，被誉为中国花卉界的“奥林匹克”。第十届中国花博会于2021年5月21日-7月2日在上海崇明举办。本届花博会选址东平国家森林公园及周边地区，园区总面积10 km2，规划布局“一轴、一带、三区”（主题演绎轴、十里花溪带、核心展示区、森林景观区和配套服务区），充分展示我国花卉领域的最新成果和花卉产业的高质量发展。筹办花博会是上海贯彻落实习近平同志“绿水青山就是金山银山”“建设美丽中国”等富有生态智慧的重要论断的行动体现，对促进崇明“世界级生态岛”建设、凝聚绿色发展产业的核心竞争力具有十分重要的推动作用，并为上海在贯彻落实“长三角一体化”国家战略过程中，打造具有区域特色的绿色发展体系、促进生态建设与保护能级提升起到重要的引领性示范作用。

植物的引种布展和园区的生态景观营建是本届花博会各项工作中的中心任务，在这一任务的落实过程中，生态风险防范亟需高度重视。国内外重大会展或活动类盛会的经验和教训得出，生物风险历来是这些活动中最重要的生态风险源，特别是由人类活动及植物引种与调运导致的有害动植物的传播与危害，可以形成严重的生态后果，其对区域生态系统健康和相关产业发展带来的负面影响甚至是不可逆转的。例如，2004年雅典奥运会的举办，导致棕榈科大害虫红棕象甲入侵，其在东地中海地区对当地绿化景观构成了极其严重的破坏，造成的生态影响至今仍未消除[7-8]。

崇明花博会的生物灾害风险主要来自以下几个方面：频繁的植物调运和高密度人流使潜在危险性有害生物导入风险极大。参展植物逃逸导致外来植物入侵的可能性增加是本届花博会面临的另一重大生态风险。2021年在崇明举办的第十届中国花博会，从岛外大规模输入活体植物、木质包装品及种植介质，使得崇明岛的生态安全遭受重大威胁，其面临的生态风险远超2010年上海世博会。经过前期的风险分析，认为TRV随种苗调运传入崇明岛的风险较高，因此将其列为本次花博会重点防控的有害生物。作为一种寄主范围广泛的病毒，TRV不仅毒力强、株系多，而且存在巨大的危害和潜在风险。对这些风险进行提前预判，构建有效的防控体系，是科学化解相关风险的有效途径。文章拟从TRV的生物学特性、诊断检测及监控技术等方面进行阐述，为防范TRV随种苗再次传入及传播扩散提供参考。

1 病毒特性

TRV是侵染性较强的病毒，其病毒粒子为刚直杆状，无包膜，直径20～23 nm，病毒为二分体病毒，有两种典型长度，180～215 nm的粒子包含RNA1，而46～1 15 nm的粒子包含RNA2，侵染时必须包含两种粒子。TRV体外稀释限点为10-5～10-6。室温下病毒粒子在粗提液中保持侵染性超过2个月，而在冷冻状态下，其侵染性可保持长达1年。体外致死温度80℃～85℃[9]。根据病原特性、血清学关系、指示植物症状及线虫介体的不同，TRV划分为多个株系[10-11]。按照血清学关系，可分为PRN、ASH、SYM和Jeff 4组，其中PRN血清型是分布最广经济价值最重要的株系[12]。

2 生物学特性

2.1 寄主植物和症状

TRV寄主范围很广，超过50个科400种双子叶和单子叶植物易受侵染。自然条件下能侵染郁金香（Tulipa gesneriana）、风信子（Hyacinthus orientalis）、水仙（Narcissus tazetta）、一串红（Salvia splendens）、旱金莲（Tropaeolum majus.）、矮牵牛（Petunia hybrida）、过路黄（Lysimachia nummularia）、八仙花（Hydrangea macrophylla）、杓兰（Cypripedium reginae）、透骨草（Phryma leptostachya）、菠菜（Spinacia oleracea）、番红花（Crocus sativus）、小苍兰（freesia hybrida）、芫荽（Coriandrum sativum）、向日葵（Helianthus annuus）、萝卜（Raphanus sativus）、 豌 豆（Pisum sativum）、 菠 菜（Spinacia oleracea）、 罗 勒（Ocimum basilicum）、大豆（Glycine max）、甜菜（Beta vulgaris）、马铃薯（Solanum tuberosum），以及芍药属（Paeonia）、景天属（Sedum）、茄属（Solanum）等花卉、蔬菜及其他经济作物，此外部分苋属（Amaranthus）、蒿属（Artemisia）、车前草属（Plantago）等野生杂草也是其寄主。侵染甜菜、菠菜等会引起褪绿、局部坏色斑和系统斑驳；侵染马铃薯等产生局部坏死斑或坏死条纹；侵染烟草等引起局部坏死或褪绿环斑，系统坏死、条纹或斑驳；侵染玉簪和百合等则产生斑驳症状（图1）。但有时因为株系不同，寄主不表现明显的症状。当前，TRV诊断的鉴别寄主为苋色藜、黄瓜、烟草和菜豆。

1. TRV侵染部分寄主症状（源自网络）

2.2 传播途径

TRV不能通过地上部分的昆虫介体或农事操作进行传播。在育苗田或农田中主要是通过毛刺线虫属（Trichodorus）和拟毛刺线虫属（Paratrichodorus）的线虫进行传播，已知共有14种线虫可传播该病毒。T. primitivus、T. similis和P. pachydermus是最广泛的传播介体[13-14]。有试验表明，病毒株系与介体种类之间存在一定的转化性。成虫和若虫可以传毒，但是介体蜕皮后则不再持毒。线虫通过取食系统感染的植物的根部1 h获毒，并在1 h之内保留传毒能力，但有些线虫可保持传毒能力达3个月。有人认为，病毒颗粒粘附到介体的食管壁上，当线虫进食时连同唾液一起被分泌到根细胞。但是没有病毒在介体内增殖的证据，因此，病毒不能通过线虫的卵传播。线虫在10℃以上时，可传播病毒，在15℃～20℃传毒效率最高[15]。

TRV可在一些多年生杂草中越冬，成为次年病毒侵染的初侵染源。在野生堇菜（Viola arvensis）中传毒的效率接近10%，在其他一些杂草中传毒的效率更低[16]。另外至少有6种菟丝子可以传播TRV。TRV虽可通过种子传播，在甜菜种子中的种传率可达5%～15%[17]，但种子传播不是主要传播方式。带毒的鳞球茎花卉类种球如水仙、郁金香、百合、番红花等是该病毒远距离传播的主要方式。

2.3 作为沉默载体应安全使用

在烟草（Nicotiana tabacum）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、马铃薯等植物基因功能鉴定研究中，TRV常被用作诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）载体。常见的RNA病毒载体有烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）、TRV等[18]。TRV作为诱导基因沉默的载体是目前应用最广的载体之一，具有寄主范围广、沉默效率高、持续时间长等特点[19]。TRV为二分体RNA病毒，TRV载体是包括RNA2（pTRV2）和 RNA1（pBINTRA6）cDNA的双元表达载体。尤其是在植物抗性基因的发掘方面，利用TRV成功在番茄中克隆到了一个NBS-LRR类抗病基因[20]。鉴于TRV在我国发生分布较少，一旦传播扩散将对农林业生产构成威胁，作为病毒载体使用广泛，各个实验室应加强使用的安全管理，严防其泄露传播。

3 经济影响

在北美、欧洲、日本、新西兰等地区，无论是严重发生业已本地化，还是尚没有发生需要严加防范，TRV对很多国家蔬菜和花卉等的安全生产存在巨大风险。马铃薯块茎是受TRV影响较大的作物，在生产过程中叶片出现斑驳症状，影响植物的光合作用，而且能直接侵染马铃薯块茎导致软腐症状，使其失去商品价值而导致严重的经济损失[21]。美国西北部地区由烟草脆裂病毒引起的马铃薯软腐病发生频率为5%～10%，有时影响整个田地作物的销售[22]。意大利南部地区因TRV和其他病毒混合侵染，导致莴苣产量有损失，而中部地区辣椒约30%～40%受TRV侵染，产量显著减少[23]。在德国，TRV广泛分布，侵染胡萝卜导致产量损失10%～30%[24]。而花卉作物感染TRV虽没有详细的经济损失报道，但一旦受到侵染，显然会影响花卉的产量和品质。一旦因为花博会种苗的大量调运而使TRV传播扩散，而目前对该病毒无有效防控措施，有可能对崇明岛的生态环境和农作物生产造成不可逆转的影响。

4 检测鉴定方法

有多种方法可对TRV进行检测和鉴定。生物学鉴定方法，即以摩擦法将TRV接种到指示植物或鉴别寄主黄瓜、烟草、苋色藜、菜豆上，当任意一种鉴别寄主出现褪绿、局部坏死斑或系统性的扭曲或坏死时，判定带有TRV。然而，症状也同时受到环境条件和病毒株系的影响，一些病株产生症状或根本就不产生症状，接种后可通过血清或分子生物学方法进一步检测鉴定。ELISA方法是一种快速、简单易学且需实验设备较少的一种方法，但是某些株系由于血清学关系较远或病毒含量太低而被漏检，目前在ELISA的基础上还开发出灵敏度更高、特异性更好的Dot-ELISA、组织印记ELISA等多种方法。分子生物学技术方法的应用大大提高了TRV检测的灵敏度、准确性和检测效率。其中应用最普遍的为RT-PCR法和实时荧光RT-PCR法，使检测灵敏度达到fg级，远远高于血清学方法，而且通过序列分析，还可确定病毒的株系[24]。此外，血清学和PCR技术相结合的免疫捕获PCR方法，更进一步提高了检测的特异性和灵敏度。为了适应口岸一线检测要求，也发展建立了基因芯片检测、多重RT-PCR检测等方法[25-27]，通量高，检测速度快。但首次检出或某一地区首次发生时，应在分子检测结果的基础上，通过生物学或血清学方法再次进行验证[28]。在本次花博会中，采用RT-PCR和Dot-ELISA等方法对进口的种球、宿根等样品进行TRV检测，结果从一批荷兰进口的芍药宿根中检出该病毒。

5 监测防控技术

（1）检疫措施。鉴于TRV可通过种苗传带，一方面要通过口岸检疫来防止该病毒由贸易国家跨境传入中国，为生产目的引进的种苗，要在海关总署指定进境口岸入境且根据引进目的在隔离检疫圃隔离种植至少两个生长季，观察并检测植株是否带毒；另一方面要对云南等地的TRV进行监测，防止通过国内的花卉苗木调运进一步扩散。郁金香、风信子、水仙、芍药、番红花等种球是花博会从国外大量引种的花卉，也是TRV常感染的寄主。在进口通关的过程中应加强对该病毒的检测，同时加强后续监测。

（2）改变种植方式。轮作非线虫寄主植物或休耕是减少侵染源的主要方式，在种植马铃薯之后土地休耕控制TRV的传播具有明显的效果[29]。另外彻底清除寄主植物附近的杂草也是切断初侵染源的主要措施之一。

（3）控制传播媒介。线虫是TRV的主要传播媒介。通常有效的控制方法就是在认证体系下种植健康植株，定期施用杀线虫剂防治线虫，但线虫常生活于地下1 m的土层中，药剂熏蒸效果并不理想，因此常利用溴甲烷、威百亩、必速灭、二氯丙烯等熏蒸剂控制苗床线虫种群数量[30]。

（4）选育培育抗病或耐病品种。借助常规育种或通过转基因选择育种，培育或选育抗病或耐病品种是控制TRV最有效的途径[31-32]。通过不同类型或不同TRV抗性机制，已经培育或选育出抗TRV或耐TRV的马铃薯等新品种。

6 展望

TRV虽仅在我国局部区域分布，但其对蔬菜、花卉产业危害严重，潜在威胁巨大，加之TRV感染之后很难医治，只能拔除销毁，引起巨大经济损失；另一方面，近年来国内从境外大量引进花卉种球、植株，TRV随种植材料再次传入中国并进一步传播扩散的可能性极大，而TRV寄主范围广，国内随处可见，其传播介体在国内也多有分布。当前，上海地区尚未在野外发现TRV的发生分布，针对2021年在崇明举办的第十届花博会，相关单位和部门有针对性地对多批次的花卉种球进行检验，防止其通过重大工程等途径传入上海，一旦其在上海定殖扩散，防治难度极大。在充分了解TRV生物学特性的基础上，建立准确、快速的检测方法，制定有效的防范措施，对入驻花博会的种苗加强检测和鉴定，杜绝传染源，切断其传入途径，确保崇明世界级生态岛和上海城市的生态安全。