青稞普通根腐病的调查与病原鉴定

李雪萍 ，刘梅金 ，许世洋 ，郭建炜 ，漆永红 ，李敏权 *

（1. 甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃兰州730070；2. 甘肃省甘南州农业科学研究所，甘肃合作747000；3. 甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州730070）

青稞（Hordeum vulgarevar.nudum）是多棱裸粒大麦统称，在我国主要种植于西藏、青海、云南、甘肃、四川等省区海拔较高的地区，其成熟期短、耐寒性强，在海拔超过4200 m 的高寒地区，青稞是唯一能够正常成熟的谷物，因此，在古埃及和我国的藏区也常被当地居民作为主食［1］。同时，青稞在澳大利亚、欧洲马其顿、美国北部大平原、加拿大西部等多个国家地区及我国多个地区常被作为饲用作物，其富含多种氨基酸、膳食纤维、维生素、β−葡聚糖以及钙、镁、磷、锌、锰、硒等矿质元素，亦常被用来酿酒及现代健康食品的加工等［2］。由此可见，青稞的生产不仅保障了高原地区畜牧业的发展及当地居民的基本生活，更为现代人民健康生活水平的提升做出了贡献。

然而，植物病害严重影响了包括青稞在内的大麦类作物的生产。据Murray 等［3］报道，澳大利亚在1998−2007 年这10 年间，由植物病害造成大麦（Hordeum vulgare）损失每年达2.52 亿美元，是总产值的19.6%。在美国北达科他地区及加拿大，根腐病造成大麦减产近10%［4］。青稞感染根腐病后根和芽的鲜重、干重、谷粒数均大幅下降，从而导致总产量降低；分析其营养成分发现，其总碳水化合物下降23.28%～82.77%，蛋白质下降0.55%～76.62%，脂肪下降28.45%～79.25%［5］。目前，对大麦类作物病害的研究主要集中在大麦条纹病［6−7］、锈病等［8−9］方面，对于根腐病的研究较少，对青稞根腐病的研究仅有本课题组报道［10−11］，而根腐病病害类型复杂，病原多样，因寄主、环境、气候、土壤等各种因素而异。鉴于此，本研究对西北青藏高原地区的青稞根腐病进行了调查，明确其危害程度及发病症状，并采集样品进行病原分离鉴定、致病性测定，以期为青稞根腐病的防控及致病机理的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 调查研究区概况

调查研究区选择甘肃省甘南藏族自治州合作市、卓尼县、临潭县以及青海省海北藏族自治州刚察县、海东市互助土族自治县等我国重要的青稞生产区。其位于青藏高原东部及北部边缘，平均海拔2800 m 以上，无霜期短，日照时间时长，是典型的大陆性气候，青稞是该地区适生作物，也是该地区最主要的粮饲作物。

1.2 调查采样

参考《植病研究法》［12］对该区域青稞发病率进行调查统计，避开地边5 m，挑选植株枯黄或长势明显很弱，且发病植物地下部普遍有根腐症状的地块，统计其占总地块的面积比例，即其发病率，据此计算同一地区所有地块的平均发病率，即该地区青稞普通根腐的发生率；采用多点采样法采集发病特征典型的疑似青稞普通根腐病植株，低温运输至实验室进行研究。

1.3 病原的分离与纯化

刷掉青稞病株根部土壤，清洗干净并自然风干。从根部的病健交界处剪下根段，70%的酒精消毒2～3 s 并用无菌水冲洗干净，放入0.1%的升汞溶液中消毒10 s，再用无菌水洗4 次，用无菌滤纸吸干表面水分；然后用无菌解剖刀切去根段两端，将中间的根段接于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA；培养基成分：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL）平板之上；约3～4 d 后，将根段的两端长出的菌丝转移到另一PDA 平板之上，并采用单孢分离法［13］对其进行纯化。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态鉴定 观察并记录菌株在PDA 培养基上的菌落形态特征，在显微镜下观察其菌丝及孢子形态，参照《真菌鉴定手册》［14］、《中国真菌志》第十六卷（链格孢属）［15］、第三十卷《蠕形分生孢子真菌》［16］，确定其分类地位。

1.4.2 分子生物学鉴定 将待鉴定菌株活化后接于马铃薯葡萄糖培养液中，120 r·min−1、25 ℃摇床培养5 d，收集菌丝体，Fungal DNA Kit 试剂盒（OMEGA）提取DNA（操作步骤依据试剂盒说明书）。选用ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS2（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）引物进行 PCR 扩增。反应体系为：总体积 25 μL、基因组 DNA 1.0 μL、10×Buffer（含 2.5 mmol·L−1Mg2+）2.5 μL、Taq 聚合酶（5 U·μL−1）0.5 μL、dNTP（10 mmol·L−1）1.0 μL、Primer（±10 μmmol·L−1）1 μL、ddH2O 补至 25 μL。PCR 参数为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 80 s，重复扩增35 个循环，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。反应完成后，取2 μL PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后委托北京天一辉远生物科技有限公司进行测序。得到测序结果后在NCBI 中进行Blast 比对并选取参考序列，利用MEGA 7.0 中的最大似然法（1000次重复）构建系统发育树，确定其分类地位，并将结果提交至GenBank，获得登录号。

1.5 致病性测定

根据前期研究结果，烧杯水琼脂法可以较好、较便捷的反应菌株的致病性［13］，具体为：1）将待测菌株活化后接种于1.2%的水琼脂（water agar，WA）培养基上，置于25 ℃培养3 d。2）将供试种子（品种为藏青2000，由甘南州农业科学研究所提供）消毒后25 ℃催芽48 h。3）挑取发芽一致的种子均匀摆放在带菌的WA 培养基上，并在不接菌的WA 培养基上接入种子作为对照，每杯放入10 粒，锡纸封口后放入人工气候箱（两个阶段：第一阶段为时间8 h，光80%，湿度60%，温度25 ℃；第二阶段为时间16 h，光照为0，湿度80%，温度20 ℃）。待种苗长至烧杯口处时揭去锡纸，打开纸盒盖，继续在人工气候箱中培养，8 d 后观察发病情况，参考田间发病情况及发病症状，确定分级标准，统计病级，计算其发病率及病情指数。

分级标准：0 级−健康无病，叶绿，根与根茎白；1 级−根系有褐色斑点出现，但不超过30%；2 级−根系成段变褐，但不断裂，不超过30%；3 级−根系成段变褐甚至变黑，容易断裂，不超过50%；4 级−根系成段变褐甚至变黑，断裂腐烂，大于50% 或整个植株死亡。

将致病性测定后病株每菌随机挑出3 株，剪下其种子或病根，接种于PDA 培养基上，于25 ℃下培养7 d 后镜检观察其孢子形态，在此期间不断观察其菌落形态，确认是否与接入时的菌株一致。

1.6 数据分析

相关数据整理及分析采用Excel 2007 和DPS 15.10 完成，采用Duncan 新复极差法进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 发生分布

青稞普通根腐病主要分布在甘肃省甘南藏族自治州临潭县古战乡，卓尼县柳林镇、阿子滩乡、完冒乡，合作市卡加曼乡以及青海省海北藏族自治州刚察县，海东市互助土族自治县林川乡。发生较为普遍，田间发病率为5%～15%（表1）。

表1 青稞根腐病的调查Table 1 Investigation on root rot of qinke barley

2.2 发病症状

青稞苗期普通根腐病不易识别，其症状为地上叶片多表现为叶色淡，呈黄绿色，幼苗瘦弱或死亡，有明显的发病中心，挖出洗净后可发现其根部发黑，容易断裂或腐烂；青稞成株期普通根腐病多表现为穗白粒瘪，茎秆甚至叶片呈黑褐色，挖出洗净后亦可发现根部黑褐断裂或腐烂（图1）。

图1 青稞普通根腐病症状Fig.1 Qingke barley common root rot symptoms

2.3 病原鉴定

2.3.1 形态特征 共分离得到13 株青稞普通根腐病病原，其中8 株在PDA 培养基上均呈现青灰褐色，气生菌丝发达，厚绒状，易产生大量分生孢子，孢子呈淡黄褐色至灰褐色，易从两端萌发，拟纺锤形，多数较直，少数弯曲，平均大小为（63.62～79.36）μm×（18.99～22.46）μm（图2），初步鉴定为麦根腐平脐蠕孢（Bipolaris sorokiniana）。

图2 麦根腐平脐蠕孢的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of B. sorokiniana

其中5 株菌落呈青灰褐色，菌丝发达，在PDA 培养基上容易产生大量的分生孢子，分生孢子黄褐色至青灰褐色，形状大小不一，有横隔膜，斜隔膜和纵隔膜，平均大小为（24.86～41.66）μm×（8.32～13.92）μm（图3）。初步鉴定为链格孢（Alternaria alternata）。

图3 链格孢的形态特征Fig.3 Morphological characteristics of A. alternate

2.3.2 分子鉴定 如图4 所示，以木贼镰孢及链格孢等作为外群，构建系统发育树发现，D26-2、D23-1、D22-1、D13-1、D32-6、D28-3、NQ4-3、Q7-6 这 8 株菌与麦根腐平脐蠕孢聚为一类，遗传距离为 0，自展支持值为 100（1000 次重复）。结合形态特征鉴定的结果，确定本研究分离到的此8 株菌均为麦根腐平脐蠕孢。提交序列至GenBank，获得的登录号分别为 KY365567（D26-2）、KY365566（D23-1）、KY365565（D22-1）、KY365575（D13-1）、KY365569（D32-6）、KY365568（D28-3）、KY365583（NQ4-3）、KY365590（Q7-6）。

图4 基于rDNA ITS 区序列构建的麦根腐平脐蠕孢系统发育树Fig.4 B. sorokiniana phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

同时，以麦根腐平脐蠕孢作为外群，构建系统发育树发现，D28-1、D34-1、D3-4、NQ3-4、D33-2 这5 菌株与链格孢的遗传距离为0，自展支持值大于99（1000 次重复）。结合形态特征，确定该5 株菌为链格孢。提交序列至GenBank，获得的登录号分别为 KY365561（D28-1）、KY365563（D34-1）、KY365573（D3-4）、KY365582（NQ3-4）、KY365562（D33-2）（图 5）。

图5 基于rDNA ITS 区序列构建的链格孢系统发育树Fig.5 A. alternate phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

2.4 致病性分析

如表2 所示，8 株麦根腐平脐蠕孢均可导致青稞普通根腐病的发生，发病症状与青稞田间苗期普通根腐病症状一致，除D13-1 及NQ4-3 外，其他6 株菌可100%引起青稞普通根腐病的发生，其中D32-6、Q7-6、D26-2 和D28-3 这4 株菌的致病性最强，病情指数均在80%以上，且各菌株的致病性差异显著。经再次分离病原观察其形态特征发现，与接入时一致，确认为该种病害的病原。

表2 青稞普通根腐病病原-麦根腐平脐蠕孢的致病性Table 2 The common root rot pathogen of qinke barley-B.sorokiniana pathogenicity

如表3 所示，5 株均有致病性，致病差异显著；链格孢的致病性较低，致病性最强的D28-1 发病率为89.17%，病情指数为36.42；发病症状与田间苗期普通根腐病轻症一致，经再分离发现，其菌株形态与接入时一致，确认为普通根腐病病原。

表3 链格孢的致病性Table 3 The A.alternate pathogenicity

3 讨论

目前，关于青稞根腐病的研究较少，病原研究鲜见，可查阅到的资料多为大麦根腐病的相关研究，并非其变种青稞，因此，本研究首次明确了青稞普通根腐病的病原。本研究发现，青稞普通根腐病的优势病原是麦根腐平脐蠕孢，与 Ilija 等［17］、Mohammad 等［18］和Zhong 等［4］对大麦根腐病病原的研究结果一致。也有众多研究表明大麦根腐病的优势病原为镰孢菌，主要包括燕麦镰孢、黄色镰孢、禾谷镰孢、梨孢镰孢、拟枝镰孢等［19−22］。然而，有研究发现，大麦根腐病是由多种病原复合侵染引起的，如 Makela 等［23］、Pua 等［24］和 Fedel 等［25］研究表明，大麦根腐病是由麦根腐平脐蠕孢和镰孢菌属共同引起的。Amira［26］和 Ravjit 等［27］则研究表明，丝核菌和镰孢菌是引起大麦根腐病的优势病原。前人对大麦根腐病病原的研究做出了巨大贡献，但未见将根腐病害类型作以区分。究其原因，根腐类病害发生的环境复杂，受气候、种植、土壤等多个因素的影响，不同类型的根腐类病害往往混合发生，症状类似，从而对根腐类病害类型的确定造成了困难。本研究通过大量调查采样及试验研究发现以麦根腐平脐蠕孢为优势病原的青稞根腐类病害，其症状典型，与镰孢菌根腐病等其他根腐类病害差异较大，确定为青稞普通根腐病。麦根腐平脐蠕孢是小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、柳枝稷（Panicum virgatum）等植物叶斑病［28−30］、根腐病［31］以及燕麦（Avena sativa）褐斑病［32］等多种作物病害的病原，其侵染规律、致病机理及各种病害之间的关系有待进一步研究。另外，近年来，越来越多的研究证明，链格孢能引起叶斑病、果腐病、根腐病、黑斑病等多种植物病害，其寄主广泛，致病性强，产生毒素，危害严重［33−34］。本研究发现，5株链格孢可致病导致青稞根腐病的发生，但未见只分离到链隔孢的病株，其可能与麦根腐平脐蠕孢复合侵染或在麦根腐平脐蠕孢侵染后加重发病程度，其互作机理还有待进一步研究。

4 结论

我国西北青藏高原地区甘肃省甘南藏族自治州、青海省海东市、海北藏族自治州青稞普通根腐病发生普遍，发病率为5%～15%。青稞感染普通根腐病后叶呈黄绿色，穗白粒瘪，幼苗瘦弱或死亡，根部发黑、腐烂或断裂。青稞普通根腐病的病原为麦根腐平脐蠕孢和链格孢，麦根腐平脐蠕孢为优势病原。