奥利司他对大鼠非酒精性脂肪肝的保护作用及机制研究

姚瑞强

（山西医科大学汾阳学院，山西 汾阳 032200）

肝脏脂肪含量被认为是糖尿病、心血管疾病的重要危险因素，减少肝脏脂肪沉积可减少肝细胞凋亡、坏死及炎症反应，非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是无过量饮酒史人群以肝实质细胞脂肪变性及脂肪储积为特征的病理综合征，包括非酒精性肝脂肪变性（Non-alcholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化及肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）[1-2]。磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）具有脂类激酶及蛋白激酶活性，PI3K家族作为机体生长因子信号传导中一类重要因子，可被多种细胞因子及理化因素激活，并催化磷脂酰肌醇，使其羧基端发生磷酸化，继而出现有信使作用的肌醇类激酶，蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为PI3K/AKT信号通路的主要下游分子，在各种信号级联中充当PI3K下游的主要信号转导物，该信号通路有促凋亡、增殖、分泌、趋化等作用[3]。研究发现PI3K/AKT通路的抑制可导致胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR），继而促进NAFLD的进展[4]。奥利司他作为非中枢性减重药物，可与胃、胰脂肪酶的丝氨酸残基结合，使脂肪酶失去活性，导致食物中的脂肪不能被分解为游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA），抑制脂肪利用及吸收。早期有研究发现，奥利司他可作为治疗药物来改善肝脏损伤性生化指标，但非首选药，可作为姑息治疗选择[5]。Esmail等人最新研究发现，短期奥利司他疗法可改善NAFLD和代谢综合征患者脂肪浸润指数、肝纤维化评分[6]，然而目前关于奥利司他对NAFLD的作用机制研究甚少。本文主要分析奥利司他对NAFLD模型大鼠的保护作用及PI3K/AKT信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

健康清洁级6～8周雄性SD大鼠（165~190 g）30只，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.2 主要仪器与试剂

BS-0220生化分析仪（深圳迈瑞），UV-2550分光光度计（日本津岛）；电泳仪（美国BIO-RAD），凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD）。高脂饲料，上海斯莱克；甘油三酯（Triglyceride，TG）、空腹血糖（Fiber bragg grating，FBG）、空腹胰岛素（Fasting serum lisulin，FINS）测定试剂盒均购自北京中生北控生物科技；谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷氨酰转移酶（γ-Glutamyltransferase，GGT）、天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量分析试剂盒（Thermo Fisher公司）；PI3K和AKT一抗购自Thermo公司。

1.3 动物分组与处理

所有大鼠随机分为3组，每组10只，以普通饲料适应性喂养1周后，开始对大鼠进行为期8周的NAFLD模型构建。对照组继续喂食普通饲料，模型组改喂食高脂饲料，奥利司他组在模型组饲养基础上灌胃奥利司他（规格：60 mg，湖南明瑞制药，国药准字：H20183303）60 mg·（kg·d）-1。记录每日摄食量。在实验结束前12 h开始禁食，自由饮水。实验结束时称量大鼠增长体质量。

1.4 血糖代谢水平测定

禁食10 h后进行葡萄糖耐受实验，取大鼠尾静脉血分离血清，测定FBG。同时按试剂盒说明书测定腹主动脉血清FINS，计算胰岛素敏感指数（Insulin sensitivity index，ISI），ISI=l/（空腹血糖×空腹胰岛素）。

1.5 肝脏脂质及血清生化指标测定

禁食12 h后乙醚麻醉大鼠，腹主动脉取血，取肝脏、肌肉等脏器组织称重。每只大鼠准确称取20 mg肝脏，制作肝脏匀浆，依据试剂盒说明书测定TG。匀浆经室温静置30 min后3000 rpm离心10 min分离血清，测定AST、GGT、ALT。

1.6 组织学检测

取新鲜肝组织，以OCT包埋剂包埋，甲醛钙固定，60%异丙醇清洗，油红O染色液染色，60%异丙醇洗浮色，蒸馏水水洗，苏木精复染核，蒸馏水洗，晾干后封片观察、摄片。

1.7 肝组织蛋白检测

采用Western blot法测定肝组织PI3K、AKT蛋白表达水平。取适量肌组织加RIPA裂解液，提取蛋白，以BCA试剂盒测定其浓度。采用SDSPAGE电泳进行分裂，转膜，BSA封闭。加一抗及经HRP标记的二抗孵育，加化学发光试剂显色，拍照并统计灰度值。

1.8 统计处理

应用SPSS23.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±SD）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 摄食量、体质量、肝脏质量比较

摄食期间三组摄食量、增长体质量差异无统计学意义（P＞0.05），模型组、奥利司他组肝脏质量高于对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2 肝组织油红O染色结果

对照组肝细胞胞浆、胞核呈蓝色，无明显橘红色脂滴，模型组肝细胞胞浆中可发现许多大小不等橘红色脂滴，且呈弥漫性分布，提示造模成功，奥利司他组肝细胞脂滴较模型组缩小且减少，染色变浅，但仍较对照组深。见图1。

表1 三组摄食量、增长体质量、肝脏质量比较（±SD，n=10）

表1 三组摄食量、增长体质量、肝脏质量比较（±SD，n=10）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别 摄食量（g·d-1） 增长体质量（g） 肝脏质量（g） 对照组 19.18±2.03 56.82±5.86 14.21±1.58 模型组 21.22±2.25 60.44±6.18 22.03±2.54* 奥利司他组 21.36±2.35 60.72±6.13 22.75±2.38*

图1 各组大鼠肝组织油红O染色结果（×200）

2.3 肝组织脂质含量与肝功能酶学指标比较

模型组TG、ALT、GGT、AST明显高于对照组（P＜0.05），奥利司他组TG、ALT、GGT、AST明显低于模型组（P＜0.05）。见表2。

2.4 三组血糖代谢指标比较

模型组FBG、FINS高于对照组（P＜0.05），ISI明显低于对照组（P＜0.05），奥利司他组FBG、FINS明显低于模型组（P＜0.05），ISI明显高于模型组（P＜0.05）。见表3。

2.5 三组PI3K、AKT蛋白表达水平比较

与对照组相比，模型组肝组织PI3K、AKT蛋白表达水平更低，而奥利司他组的肝组织中PI3K、AKT蛋白的表达水平高于模型组（P＜0.05）。见图2。

表2 三组脂质含量与肝功能酶学指标比较（±SD，n=10）

表2 三组脂质含量与肝功能酶学指标比较（±SD，n=10）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别 TG（mg·g-1） ALT（IU·g-1） GGT（IU·g-1） AST（IU·g-1） 对照组 10.15±1.16 10.54±1.27 56.43±5.57 3.97±0.45 模型组 123.41±14.58* 28.67±2.93* 70.19±7.18* 15.13±1.62* 奥利司他组 71.89±7.26*# 18.23±1.85*# 62.35±6.37*# 13.11±1.89*#

表3 三组血糖代谢指标比较（±SD，n=10）

表3 三组血糖代谢指标比较（±SD，n=10）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别 FBG（mmol·L-1） FINS（μg·L-1） ISI 对照组 5.43±0.57 0.10±0.02 -2.35±0.26 模型组 6.54±0.68* 0.21±0.04* -3.18±0.34* 奥利司他组 5.21±0.54# 0.16±0.02*# -2.63±0.29#

图2 三组PI3K、AKT蛋白表达水平比较

3 讨论

NAFLD是由代谢应激诱导的肝损伤性疾病[7-8]。NAFLD的病因主要是IR及其代谢紊乱构成脂肪浸润肝脏首次打击，而肝脏脂质沉积也是其最大特点，因此改善脂质及胰岛素代谢是该病的治疗重点[9]。奥利司他是非作用于中枢神经系统的药物[10]，对NAFLD有改善作用，但奥利司他对NAFLD的治疗效果与机制研究甚少。PI3K/AKT为对细胞增殖、分化、凋亡及衰老进行调节的关键信号通路，与细胞增殖、凋亡之间存在密切关系[11]，关于NAFLD发展与PI3K/AKT信号通路的关系目前已有研究[12]，而奥利司他是否通过影响该信号通路对NAFLD发挥肝保护作用目前未见研究。

本研究发现奥利司他组大鼠肝细胞脂滴较模型组缩小且减少，染色变浅，但仍较对照组深，提示高脂饮食导致大量肝脏脂肪细胞沉积，而奥利司他可有效减少肝脏脂肪细胞浸润，延缓NAFLD进展[13-14]。

IR及高胰岛素血症共同作用导致肝脏内FFA及TG增多，大量FFA进入血液，使细胞色素酶P450ⅡE1（Recombinant cytochrome P450 2E1，CYP2E1）表达增多，造成氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）过量生成，多次平行撞击使氧化应激增加，脂质过氧化作用增强导致肝细胞损伤，引起炎症细胞聚集，使肝脏由炎症、NAFL到NASH及纤维化进展，从而起着双重作用，影响NAFLD发病进程。本研究对三组脂质含量及肝功能酶学指标的观察发现，奥利司他能较好减轻NAFLD的脂质代谢水平，改善其肝功能。奥利司他为非中枢性减重药，可选择性与肠道脂肪酶活性丝氨酸残基共价结合而使酶失去活性，继而抑制TG水解，使TG及FFA摄入减少，体内原有脂肪分解供能，达到控制体重、改善高血糖、高血脂的作用[15]，这也是奥利司他组糖代谢水平优于模型组的原因。

PI3K/AKT通路为胰岛素信息进行传导主要通路，参与细胞增殖、分化、凋亡及蛋白质形成、代谢等生物学过程[16-17]。AKT为PI3K/AKT信号通路中心环节[18-19]，为PI3K信号传导重要的下游靶激酶[20]。本次模型组肝组织PI3K、AKT蛋白表达水平低于对照组，奥利司他组肝组织PI3K、AKT蛋白表达水平高于模型组，表明奥利司他可通过激活PI3K/AKT信号通路而发挥对NAFLD的肝保护作用。PI3K可使其下游靶蛋白AKT磷酸化，形成p-AKT，p-AKT进一步使糖原合成酶激酶-3β磷酸化、失去活性，继而丧失诱导细胞凋亡作用，此外p-AKT也能抑制促凋亡蛋白caspase、Bad及Bax合成，从而抑制细胞凋亡，当PI3K/AKT信号通路被激活后可促进细胞增殖，相反该信号通路被抑制则可诱导细胞凋亡的发生，应用奥利司他后PI3K/AKT信号通路可调节胰岛素信号通路，介导胰岛素抵抗及细胞增殖、周期调节等，从而起到肝保护作用[21]。

综上所述，奥利司他可通过激活PI3K/AKT信号通路而保护NAFLD模型大鼠的肝功能，从而改善肝脏脂质含量、肝功能酶学指标以及血糖水平。