肝细胞癌中VEGF和c-Met的表达及其与患者临床病理特征的关系

磨福喜，吴雪铭，龙喜带，林洁，黄炳臣

(1. 广西河池市人民医院，右江民族医学院附属河池医院病理科，广西 河池 547000；2. 右江民族医学院附属医院病理科，广西 百色 533000)

肝细胞癌(hepatoellular carcinoma，HCC)为消化系统常见恶性肿瘤之一，常发生于慢性肝炎、肝硬化和异常增生结节的基础上，发生过程隐匿，多数患者确诊时已为中晚期，手术及化疗效果差，5年生存率仅10%左右[1]。在分子水平研究HCC的侵袭转移及其与微环境和机体的相互作用，寻找预测指标和治疗靶点是当前肝癌研究的热点。由于抗血管生成治疗在消化道多种恶性肿瘤的治疗中取得显著疗效，确定和评估HCC患者抗血管治疗的潜在受益者，对HCC患者的治疗尤为重要。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 可诱导微血管形成和血液循环的建立，是癌细胞生长、侵袭和转移的重要基础，在恶性肿瘤的发生发展和侵袭转移中起重要作用。肝细胞生长因子受体(c-mesenchymal-epithelia transition factor，c-Met)是肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF) 的特异性受体，HCF与c-Met发生特异性结合，激活HGF/c-Met信号通路，使该通路上多种底物发生磷酸化，调控细胞的增殖和分化[2]。我们采用免疫组织化学方法检测VEGF、c-Met在HCC中的表达，探讨两者在HCC侵袭转移的机制，为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料 收集2018—2020年河池市人民医院和右江民族医学院附属医院病理科存档的126例HCC手术切除石蜡标本，其中男98例，女28例，年龄28～72岁，平均51岁，≤50岁71例、>50岁55例，Edmondson分级Ⅰ、Ⅱ级87例，Ⅲ、Ⅳ级39例；肿瘤直径≤5 cm 57例、>5 cm 69例；有微血管浸润46例、无微血管浸润80例；癌旁伴肝硬化106例、无肝硬化20例；HBsAg阳性64例、阴性62例；伴有淋巴结转移40例、无转移86例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ80例、Ⅲ+Ⅳ46例。所有病例术前均未行放化疗或生物治疗。

1.2 试剂和方法 所有组织标本离体30 min内切开，10%福尔马林固定24～36 h，石蜡包埋。鼠抗人VEGF单克隆抗体、兔抗人c-Met单克隆抗体、SP即用型免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥公司。石蜡组织切片厚4 μm，脱蜡、水化后按照说明书免疫组化染色步骤进行。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性的肺腺癌组织作阳性对照。

1.3 结果判定 VEGF染色阳性表达定位于细胞质，c-Met阳性表达定位于细胞膜和细胞质，以黄色、棕黄色、棕褐色为阳性着色，染色结果判定标准为综合阳性细胞比率及阳性强度进行半定量评分，染色强度：无着色为0分、黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。阳性细胞百分比：阳性细胞数<10%为0分、10%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、≥76%为4分。两项得分相乘≥6分为高表达病例组，<6分为低表达病例组。

1.4 统计学方法 用SPSS 17.0软件包处理数据。VEGF和c-Met在HCC中的表达与临床病理特征的差异用χ2检验，相关分析采用列联相关系数表示，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF和c-Met在HCC组织中的表达 VEGF染色阳性表达定位于细胞质、c-Met阳性表达定位于细胞膜和细胞质，呈黄色、棕黄色、棕褐色。VEGF和c-Met在126例HCC中的高表达率分别为54.76%(69/126)和42.86%(54/126)。

2.2 VEGF和c-Met高表达与HCC临床病理特征的关系 VEGF高表达与HCC淋巴结转移和TNM分期差异有统计学意义(χ2=5.493，P=0.019；χ2=16.149，P<0.001)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、微血管浸润、肝硬化、HBsAg状况差异无统计学意义(P>0.05)；c-Met在Ⅲ、Ⅳ期的高表达率为54.35%(25/46)，明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者的36.25%(29/80)(χ2=3.906，P=0.048)，与HCC患者年龄、性别、Edmondson分级、肿瘤最大直径、微血管浸润、淋巴结转移、癌旁组织伴肝硬化等临床病理参数差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 VEGF和c-Met的表达与HCC临床病理参数的关系

2.3 VEGF和c-Met在HCC中表达的相关性 126例HCC癌组织中VEGF和c-Met均阳性表达33例、阴性36例，VEGF阳性而c-Met阴性36例、c-Met阳性而VEGF阴性21例，VEGF和c-Met在HCC中的表达无相关性(C=0.110，P=0.21)。

3 讨论

肿瘤的生长依赖肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管的生成。VEGF是诱导肿瘤血管生成的最重要分子，主要由肿瘤细胞以旁分泌方式与肿瘤血管内皮细胞表达的VEGFR-1、VEGFR-2结合，激活下游P44/P42-MAPK和PI3K-AKT通路，进而促进肿瘤新生血管的生长[3]。研究发现VEGF蛋白在消化道肿瘤和乳腺癌、子宫颈癌等多种恶性肿瘤中高表达[4-6]，并且高表达和肿瘤的转移和患者不良预后相关[7]。Li XY等[8]通过检测胃癌组织中VEGF的表达发现，VEGF表达阳性与患者淋巴结远处转移相关。黄澄澄等[9]应用免疫组化检测VEGF在结直肠腺癌组织中的表达阳性率为65.7%，随着淋巴结转移和临床分期VEGF表达率逐渐增加，与患者的性别、年龄、肿瘤发生部位和肿瘤分化程度无关。吴志国等[10]对98例HCC组织标本进行检测，发现VEGF阳性表达与HCC患者癌组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期、包膜完整性、门脉侵犯和甲胎蛋白表达均存在明显相关。体外实验发现[11]，抗血管生成药物阿帕替尼作用于HepG2细胞后，显著下调凋亡抑制基因Bcl-2、上调促凋亡基因Bax表达，说明VEGF通过Bcl-2和Bax途径促进肝癌细胞增生和抑制凋亡的作用。VEGF与其受体VEGFR-1、VEGFR-2结合，通过诱导肿瘤血管形成，促进肿瘤增殖与侵袭转移。本文实验结果发现，126例HCC组织中VEGF的阳性率为54.76%，伴有淋巴结转移、T分期越高者，其VEGF阳性率越高。提示VEGF高表达促进HCC的进展和不良预后，其机制可能与肿瘤血管的大量生成，瘤细胞浸润界面扩大和新生毛细血管基底膜的不完整性，肿瘤细胞易于进入血循环，VEGF的表达水平可以反映和判断HCC的预后。

c-Met是Met基因编码产生的具有自主磷酸化活性的跨膜受体，是存在于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)介导的信号通路中的一种多功能跨膜酪氨酸激酶，作为HGF的受体，c-Met与HGF结合使酪氨酸激酶磷酸化，激活下游信号通路。研究表明[12]，HGF/c-Met信号与多种恶性肿瘤的发生发展有关，异常激活的 c-Met可增强肿瘤细胞的增殖和侵袭转移能力。张翔等[13]对结直肠癌组织及癌旁组织中免疫组化检测c-Met表达研究发现，c-Met在癌组织中的表达明显高于癌旁组织，其在癌组织中的表达与TNM分期、淋巴结转移呈正相关，阳性患者3年存活率明显低于阴性患者。谢斌等[14]检测HCC中c-Met的表达发现其阳性表达率为38.3%，其表达与肝内转移、淋巴结转移、包膜形成及癌细胞的分化程度有关，与HCC患者的性别、年龄、肿瘤最大直径和TNM分期无关。Tang XL等[15]研究发现，安罗替尼可以体外抑制肺小细胞癌H446细胞c-Met信号转导，降低细胞活力、诱导G2/M细胞周期阻滞、降低细胞侵袭和转移，说明c-Met参与多种恶性肿瘤的发生发展，并与患者的不良预后有关。本实验发现，c-Met在Ⅲ、Ⅳ期HCC患者癌组织中的表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ期的患者，提示c-Met参与HCC的恶性进展和患者更低的生存率。作为原癌基因，c-Met与HGF结合后，促进AKT/mTOR等多种信号通路的激活，介导激活下游重要分子，抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和迁移，可作为预测HCC患者预后的指标和潜在治疗靶点。

相关分析显示，HCC组织中VEGF和c-Met的表达无相关性，提示HCC的恶性进展是多基因参与、多种信号转导途径的异常调控结果。VEGF蛋白在HCC中的高表达与肿瘤侵袭和淋巴结转移有关，c-Met的高表达可能预示更加不良的预后和低生存率。联合检测VEGF和c-Met的表达情况有助于临床对HCC患者的治疗选择和预后判断。