北京市鼠形动物感染巴尔通体的调查

李 夫，窦相峰，吕燕宁，孙玉兰，王小梅，李仁清，陈丽娟，王全意

巴尔通体(Bartonella)属于革兰氏阴性菌，能感染宿主的红细胞和内皮细胞[1]。巴尔通体种类较多，目前已发现36个种及亚种，至少有17个种或亚种对人和动物致病[2]。巴尔通体感染导致的疾病谱较广，可引起人发热、猫抓病、卡里翁病、杆菌性血管瘤病和感染性心内膜炎等[3-5]。巴尔通体病常因临床表现复杂，症状不特异而发生误诊、漏诊[6]。巴尔通体宿主广泛，可感染多种类型的哺乳动物，鼠类作为巴尔通体的主要宿主，在其存储和传播中发挥重要作用[7-9]。人类可因与携带巴尔通体的鼠类接触、或被鼠咬伤或是伤口被其排泄物污染而感染，也可能由携带巴尔通体的媒介生物如蚤类和蜱等叮咬而感染[10]。

北京市周边生态环境良好，鼠形动物种类丰富。近年来，随着人与野外自然环境接触频率的增加，部分鼠传疾病呈增多趋势[11-12]。由于巴尔通体感染导致的疾病尚无疫苗可预防，因此对动物宿主和媒介的防制仍为主要防控措施之一。目前，尚未有文献全面报道北京市鼠形动物感染巴尔通体状况，为此，本研究调查北京市16个区鼠形动物巴尔通体感染状况和遗传特征，为制定本地相关疾病的防控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集 2019年3—10月在北京市16个区采用夹夜法捕获鼠形动物，通过记录捕获样本的体长、尾长、前后足长和毛色等形态特征，根据鼠科动物检索记录表进行鼠种鉴定[13]。生物安全柜中无菌操作取动物样本的肝、脾脏，并置于圆形冻存盒中，-70 ℃保存。

1.2 核酸提取 剪取黄豆粒大小的肝、脾脏，使用Qiagen Tissue Lyser II破碎仪进行组织破碎，并按DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德国)商品化试剂盒的说明书进行核酸提取，提取的核酸置于-70 ℃保存备用。

1.3 PCR扩增和测序 使用文献报道的巴尔通体gltA特异引物[14]，上游引物：BhCS.781p(5′-GGGGACCAGCTCATGGTGG-3′)和下游引物：BhCS.1137n(5′-AATGCAAAAAGAACAGTAAACA-3′)进行PCR扩增。扩增体系：2 × AmpliTaq Gold 360 Master Mix(ThermoFisher公司)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板5 μL，去离子水补足至25 μL；反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经Qiagen QIAxcel电泳仪检测，选择片段大小在379 bp附近的特异性条带送生工生物有限公司，采用Sanger测序法，在ABI3730平台进行DNA序列测定。

1.4 序列比对和分析 测得的序列使用SeqMan软件进行手工校正和拼接，并提交美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站进行Blast比对。使用MEGA 6软件进行序列处理和比对，采用邻接法(Neighbor-jointing，NJ)构建基于Kimura-2-Parameter(K2P)模型的系统发育树，自展值设为1 000次。

1.5 统计学分析 使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，不同特征间的鼠形动物阳性率的比较采用χ2检验，两两比较的P值采用Boferroni法进行校正，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 样本采集情况 在北京市16个区的居室及周边环境、山地、林地和农田4种生境中，共捕获鼠形动物样本448只，其中褐家鼠233只、小家鼠92只，主要采集于居民区及周边环境；社鼠53只、中华姬鼠30只、黑线姬鼠25只、岩松鼠6只、仓鼠4只、棕背鼠平3只和鼩鼱2只，主要采集于山地、林地和农田(表1)。

2.2 样本检测情况 共检出46份巴尔通体阳性样本，总阳性率为10.3%；除岩松鼠，仓鼠和棕背鼠平外，各鼠种均有阳性检出；城区中，海淀区(15.0%)和石景山区(28.6%)有阳性检出，其余各区均为阴性；近郊区中，顺义区(3.1%)和门头沟区(34.2%)有阳性检出，其余各区均为阴性；远郊区中，除平谷区外均有阳性检出，阳性率均 >25.0%(表1)。

表1 北京市鼠形动物样本采集及检测情况Tab.1 Information on the collection and detection of murine-like animal samples in Beijing

2.3 不同特征鼠形动物巴尔通体感染情况 对不同鼠种之间的巴尔通体阳性率进行比较，结果显示不同鼠种间的阳性率差异具有统计学意义(χ2=114.980，P<0.001)；其中，社鼠(41.5%)、黑线姬鼠(36.0%)和中华姬鼠(30.0%)的阳性率显著高于褐家鼠(0.4%)与小家鼠(4.3%)的阳性率，而社鼠、黑线姬鼠和中华姬鼠的阳性率差异无统计学意义，褐家鼠和小家鼠之间的阳性率差异无统计学意义。对不同采样区域之间的巴尔通体阳性率进行比较，结果显示不同采样区域之间的阳性率差异具有统计学意义(χ2=22.133，P<0.001)；其中，远郊区的阳性率(21.7%)显著高于近郊区(6.5%)和城区(5.9%)的阳性率，但近郊区和城区之间的阳性率差异无统计学意义。对不同生境之间样本的巴尔通体阳性率进行比较，结果显示不同生境样本的阳性率差异具有统计学意义(χ2=96.466，P<0.001)；其中，山地(33.3%)和林地(31.5%)的阳性率显著高于居室和周围环境的阳性率(1.7%)，但山地和林地间的阳性率差异无统计学意义，此外，农田(8.8%)的阳性率显著低于山地的阳性率(表2)。

表2 不同特征鼠形动物巴尔通体感染情况Tab.2 Bartonella infections according to different characteristics of murine-like animals

特征样本数阳性数(%)χ2值P值 近郊区21414 (6.5) 远郊区11525 (21.7)采样生境96.466<0.001 山地6321 (33.3) 林地5417 (31.5) 农田343 (8.8) 居室及周围环境2975 (1.7)

2.4 系统发育树分析 PCR阳性扩增产物经测序，共获得40条符合质量的序列，与GenBank中获取的国内外33条不同种属的巴尔通体gltA基因序列进行比对，截齐后的片段对应Bartonellahenselae(L38987.1)gltA基因的碱基位置为823～1085，并基于该部分序列构建系统发育树。如图1所示，40份样本位于进化树上的8个不同分支；其中，25份样本与巴尔通体(Bartonellaspp.)未定种位于同一个分支；样本MTG4、MTG11和HD1与分离自美国社田鼠的B.grahamii(KT327033.1)亲缘关系最近，序列相似性大于98%；样本MTG3、MY3、MY6和MY7与B.rattimassiliensis(AY515125.1)亲缘关系最近，相似性大于96%；MTG19和MY32与B.queenslandensis(EU111798.1)亲缘关系最近，相似性大于97%；HD6与B.taylorii(AF191502.1)亲缘关系最近，相似性为92%；YQ7与B.elizabethae(KT327032.1)亲缘关系最近，相似性为96%；HD4、MTG5和YQ1与B.japonica(AB242289.1)亲缘关系最近，相似性大于99%；YQ31与B.phoceensis(AY515126.1)亲缘关系最近，相似性为99%。

系统发育树上各分支上方数字为bootstrap值图1 基于巴尔通体gltA部分序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree constructed on the basis of partial sequences of Bartonella gltA

3 讨 论

本研究首次在北京市全市范围内对鼠传巴尔通体的感染情况进行调查，结果显示，鼠形动物巴尔通体的总感染率为10.3%，与我国福建、海南等地报道的感染率接近[15-16]。我国各地鼠类的巴尔通体感染率差异较大，其中，黑龙江和内蒙古等地的感染率可高达13.8%～57.7%和56.4%，这与当地气候、生态环境和啮齿动物种群分布有关[17-18]。北京市地形以山地和平原为主，周边远郊区域多为山地，城区和近郊区多为平原，生态环境、鼠形动物种群密度和种类分布差异较大。本研究结果显示，远郊区的阳性率(21.7%)显著高于近郊区(6.5%)和城区(5.9%)的阳性率，但近郊区和城区之间的阳性率差异无统计学意义。由于巴尔通体宿主具有多样性，山地、林地等环境的生态系统复杂，动物种群丰富，而远郊区样本多采集于山地、林地，因此，阳性率高于城区或近郊区的农田或居室及周围环境。不同鼠种间，社鼠和姬鼠阳性率(30.0%～41.5%)显著高于褐家鼠、小家鼠的阳性率(0.4%～4.3%)，但姬鼠之间和家鼠之间阳性率差异无统计学意义，这主要与北京市远郊区山地、林地的优势鼠种为社鼠和姬鼠，而城区和近郊区的居室及周边环境的优势鼠种为褐家鼠、小家鼠有关。系统进化树分析结果显示，本次检测到的巴尔通体位于进化树上的8个不同分支，其中，25份样本与巴尔通体(Bartonellaspp.)未定种位于同一个分支，而其他样本则分别与7个不同种巴尔通体聚为一个分支，同时，多个鼠种均可检出不同种的巴尔通体，表明北京市鼠形动物感染巴尔通体具有多样性特征。本次调查检测到的巴尔通体中，B.grahamii和B.elizabethae被认为与人类疾病相关，可导致发热、心内膜炎和菌血症等[19]，表明本地鼠形动物至少携带2种对人致病的巴尔通体。鼠类是多种传染病病原体的宿主[20-21]，随着本地农业、旅游和商业开发等的发展，对周边自然环境的改造可能会改变鼠类原有生态环境，造成鼠类迁徙、流窜；同时，人与自然环境的接触频率增加，使得人类感染的概率增加。因此，有效的鼠类控制措施，特别是对远郊区县的动物宿主和传播媒介的控制，将有助于减少本地人群感染巴尔通体的风险。

利益冲突：无