EB 病毒转化外周血B 淋巴细胞建永生细胞系的四种方法探讨

木耶赛尔·伊斯马依力 郭伟鹏 徐保红 乔艳辉

（乌鲁木齐市血液中心 血液研究室，新疆 乌鲁木齐 830000）

本研究利用EB 病毒转化技术，分别用环抱霉素A 转化法、外周血淋巴细胞冻存转化法、微量全血转化法、微量全血冻存转化法将部分RhD 阳性（D 变异型)献血员外周血B 淋巴细胞成功转化成永生细胞系。

1 研究对象，材料,方法，仪器设备

1.1 研究对象

本研究在知情同意原则下，在乌鲁木齐市血液中心无菌采集30 例RhD 阳性（变异型）无偿献血者血液样本，采用肝素抗凝。采集的血液样本，在运输过程中应保持常温，不要冷冻。采集的血液样本的运输尽可能地快捷，一般应在采集后24～48 小时内到达实验室。采集的血液样本在运输中应尽可能不要震荡，以避免溶血。

1.2 材料

R PM I-1640 (Biosharp 北京),淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，环孢霉素A (Cyclosporine A，CyA )购自北京索菜宝科技有限公司、胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)、三B95-8 狨猴EBV 转化的白细胞ZQ0164 购自上海中乔新丹生物科技有限公司、二甲基亚砜DMSO(德国Biofroxx)。

1.3 耗材

离心管、培养瓶、培养板、移液管、滤器、滤膜、试剂瓶、二氧化碳、液氮等。

1.4 仪器设备

超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜、高压蒸汽灭菌器、电热干燥烘箱、程序降温盒、- 80℃超低温冰箱、电动移液器、水平式离心机、超纯水仪、电子天平、恒温水浴箱、普通冰箱、超低温冰箱、液氮保存罐和转运罐。

1.5 方法

1.5.1 细胞的冻存和复苏

冻存液:90%的胎牛血清加10%的二甲基亚砜，混匀，经0.2μm 抽滤，避光保存（在4℃或-200℃）。冻存细胞时，一般每一冻存管放1ml 为好(可控制复苏时的时间)。

细胞复苏时在37℃水浴中解冻，整个过程时间约1 分钟左右。待细胞融化后用无血清的RMPI-1640 液洗涤1 次，去上清，轻弹管底将细胞弹散，重悬细胞并转入含10%胎牛血清培养基的（3ml）T-25 培养瓶中，轻轻摇动培养瓶使细胞均匀分布，放入5%CO2，37℃培养箱内。过夜后，观察细胞形态和数量，及时补充培养基。以上方法都参考文献[2]进行。

1.5.2 EBV 悬液的制备，CyA 工作液，转化培养基

EBV 悬液来自B-958 细胞培养上清液，冻存管的B-958细胞快速复苏，转入含20%胎牛血清的RPMI1640 培养液的T-25 培养瓶中，将培养瓶放入CO2培养箱中培养，每个3-4 天加一次培养液。饥饿培养7-10 天后，收集上清液，反复冻融3次，2000r/min 离心10min,上清经0.22um 膜过滤，分装后-70℃保存备用。CyA 液:，环孢霉素A (Cyclosporine A ，CyA )购自北京索菜宝科技有限公司，用无血清培养基稀释成0.2mg/ml，使用时最终浓度为2ug/ml。

1.5.3 外周血淋巴细胞的分离：取3-5ml 肝素抗凝血，加倍量的RPMI1640 液稀释，小心加在37℃预热的淋巴细胞分离液上, 3000r/min 离心30 min，小心移出界面层细胞，用RPMI1640液在1000 r/m in、10 min 条件下洗涤3 次，留下细胞沉淀。

1.5.4 四种转化方法

微量全血转化法：取抗凝全血0.1-0.5ml,置25ml 培养瓶中，加EBV 病毒1.8ml 及转化培养液培养液2ml, 置37℃，5ml/L CO2培养箱。2-3 周后可在红细胞层中观察到淋巴细胞体积增大，形态似母细胞样的细胞团，此后每3-4 天半量换液，直到红细胞及碎片基本换掉，6-7 周即可冻存。

冻存全血法：取抗凝全血0.5ml,加入1ml 细胞冻存液，混合后置低温冰箱（-40℃），2 天之后移至液氮中。细胞冻存一周以上后分批在37℃水浴快速复苏，转入T-25 培养瓶中，8ml RPMI1640 培养基，3000r 离心洗涤2 分钟，弃上清，细胞沉淀物加入新鲜EBV 上清1.8ml 和含20%FBS 的RPMI1640 培养基3ml 吹打均匀，加入25cm3培养瓶在37℃、5% CO2培养箱中静置培养。一般5-7 周后可冻存。

环孢霉素A(CyA)转化法：在洗涤3 次后的淋巴细胞装好3ml EB 病毒液及3ml RPMI1640 完全培养基的25cm3培养瓶中，再加入环孢菌素A (终浓度为2ug/ml )，置入37℃、5% CO2培养箱内培养。于5 天左右进行镜下观察，根据培养液PH 值的改变半量进行换液，约5-7 周可行细胞冻存。

冻存白细胞转化法：按1.5.3 分离淋巴细胞液，加细胞冻存液1ml 混匀后置-70℃冰箱过夜，转入液氮中冻存，2 周后复苏，转入EBV 转化转入T-25 培养瓶中，8ml RPMI1640 培养基，3000r 离心洗涤2 分钟，弃上清，细胞沉淀物加入新鲜EBV 上清1.8ml 和含20%FBS 的RPMI1640 培养基3ml 吹打均匀，加入T-25 培养瓶在37℃、5% CO2培养箱中静置培养。一般5-7 周后可冻存。

2 结果与讨论

我们采用四种转化方法转化细胞30 株，结果见表1 和图1、图2。

表1 四种EBV 转化B 细胞方法的结果

图1 转化EB 细胞一周后的结果（×200）

图2 转化EB 细胞四周后的结果（×400）

我们采用这四种方法对RhD 变异型无偿献血者血液样本进行转化，其中微量全血法转化培养5 株，4 株转化培养成功，全血冻存法转化培养5 株，转化培养成功5 株，转化培养成功4株，环孢霉素A(CyA)转化法培养15 株，转化培养成功15 株，分离淋巴细胞冻存后转化培养5 株，转化成功5 株，总计28 株转化为永生细胞系，一次建株成功率93.3%。

3 讨论

运用微量全血法，全血冻存法，环孢霉素A(CyA)转化法，冻存白细胞法对全血进行转化，均可成功建系。微量全血法在转化后2-3 周左右可见转化细胞，冻存全血法在转化7-8 天左右可见到增大的淋巴细胞，35-40 天细胞成团。按建系效率从高到低依次为:环孢霉素A 法、冻存白细胞法、冻存全血法和微量全血法。在血量充足的情况下,可选择环孢霉素A 法进行建系，得到较高的成功率，对于适合珍贵不可第二次获得的样本的处理。微量全血法和冻存全血法因具有操作简单，所需标本量少的优点，而被广泛采用。

由于各种方法转化效率各有不同，并且同一种方法对不同个体来源的淋巴细胞的转化效率也有所不同。在本项目中我们将研究不同转化方法对不同来源血液样本转化效率的区别和其中的规律，研究转化过程中的影响因素，B 淋巴细胞转化速度取决于EB 病毒浓度。文献报道[4]每瓶培养细胞加1.4mlEB 病毒，本实验刚开始加1.4mlEB 病毒，转化速度慢，两周都看不见转化细胞，后面加入1.8ml,2mlEB 病毒，结果加入1.8mlEB 病毒时转化速度最快。

由于外周血易于取材，外周血淋巴细胞就成为细胞遗传学及分子遗传学常用的研究材料。但淋巴细胞离体后生存周期短且不能增殖传代培养，常需反复抽取患者血样，如患者去世具有特定生物学形状的标本也随之丢失，这就对病人的长期深入研究带来很大困难。近年发展起来的应用EB 病毒转化人外周血B 淋巴细胞使之永生化的技术[3]，使永久保存人类基因组和特定的疾病基因组资料成为可能。

EB 病毒是一种高效率的转化病毒，它的靶细胞仅限于人类的B 淋巴细胞，对其它类型的细胞没有感染的危险性[4]。利用EB 病毒转化人类外周血细胞使成为具有永生化特性的LCL 用保存人类全基因组完全可以的。本文进一步证实，微量全血法和全血冻存法适合于短时间内采集大样本量采集、储存然后逐步转化的研究课题所选用。环孢霉素A(CyA)转化法，冻存白细胞法则适合于珍贵而且不易获得二次采样的研究课题。