羽脉山黄麻丛枝植原体的分子鉴定及病害调查*

万琼莲 王连春 王 泉 许杏萍 苏 帆 赵 静 蔡 红

(1.玉溪师范学院化学生物与环境学院 玉溪 653100； 2.云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室 昆明 650201)

羽脉山黄麻(Tremalevigata)属榆科(Ulmaceae)山黄麻属植物，是裸岩山地绿化的先锋树种(郑昌隆， 2002； 杨超本， 2013)。据《中国植物志》记载，我国山黄麻属植物有6种1变种，云南有5种，其中羽脉山黄麻可生长在向阳山坡杂木林或灌丛中，也可生长于干热河谷疏林中，海拔在150～2 800 m(陈焕镜等， 1998)。山黄麻速生，适应能力强，有造林、植被恢复、药用等多种用途，具有较高生态价值、经济价值和社会意义(刘刚等， 2006； 刘永刚等， 2014； 李媛等， 2003)。近几年发现云南省玉溪市新平县出现了羽脉山黄麻丛枝病，枝叶呈“鸟窝状”，严重影响植物生长，甚至引起树木死亡。

植原体(Phytoplasma)属于原核生物界(Prokaryotae)柔膜菌纲(Mollicutes)植原体属(CandidatusPhytoplasma)(刘仲健等， 1999)，寄生于植物韧皮部，感病植株最典型症状是丛枝、花变叶、花变绿，此外是节间缩短、小叶、黄化、枯枝(梢)、使植株长势衰退和死亡(于少帅等， 2016)，主要通过韧皮部取食的叶蝉、飞虱、木虱等昆虫传播，尤其是叶蝉和蜡蝉类(卢恒宇等， 2016),对农林业生产造成严重危害，至少影响1 000种植物，其中我国报道了100多种(McCoyetal.， 1989)。目前植原体的分类主要依据16S rRNA基因(Leeetal.， 1998)进行，根据模拟RFLP图谱的比较和相似系数的计算，目前将植原体分为33个16Sr组和超过100个亚组(Weietal.， 2007； Bertaccinietal.， 2014)。

本研究调查该丛枝病病害发生情况及危害程度；采用分子生物学方法对云南省玉溪市新平县采集到的具有典型丛枝症状的羽脉山黄麻感病植株进行植原体检测鉴定，以明确其病原及相关株系的分类地位，同时为植原体的深入研究以及本地区林业病害的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查及发病区域数据采集 根据发病区域确定调查地点为云南省玉溪市新平县哀牢山自然保护区东侧至新平彝族傣族自治县干热河谷地区省道S306沿线，45 km 地带，海拔在1 500～400 m之间。该地地势复杂，属山坡地带，因此在该区域内沿主干道进行调查，调查时间选在山黄麻植原体病害盛发期7—8月，采用随机调查的方法选取9个点，每点调查10株树，共90株树，统计其发病率，根据病害危害程度不同分为轻度(+)、 中度(++)和重度危害(+++)。

1.2 羽脉山黄麻植原体感病植株总DNA的提取 采自云南省玉溪市新平县海拔1 200 m表现典型丛枝小叶症状的羽脉山黄麻感病植株。参照“百泰克”新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(目录号为DP3112)的方法提取植株总DNA，提取样品于-20 ℃下冷冻保存备用。

1.3 PCR扩增、克隆与测序 针对植原体16 S rRNA基因采用植原体通用引物P1/P7 (P1∶5′-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3′;P7∶5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′)及R16F2n/R16R2[(R16F2n:5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′; R16R2∶5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′](Schneideretal.， 1995； Leeetal.， 1993)进行巢式PCR 扩增。将提取的总DNA稀释25倍后扩增，直接PCR扩增反应循环： 94 ℃预处理5 min； 94 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环； 72 ℃延伸10 min。巢式PCR以直接PCR扩增产物的25倍稀释产物为模板： 95 ℃预处理5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，35个循环； 72 ℃延伸10 min。用OMEGA的Cycle Pure Kit(D6492)试剂盒对PCR产物纯化加A(TaKaRa TaqTM,R001A)，与pMD19-T (TAKARA) 载体连接后，转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α (全式金，CD201-01)中，菌落PCR反应筛选阳性克隆后由上海铂尚生物技术有限公司进行序列测定。

1.4 序列在线分析与系统进化树的构建 将测序所得DNA序列在GenBank中进行BLAST比对，确定是否为植原体。再通过植原体在线分类鉴定工具iPhyClassifier(https:∥plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi)针对植原体16S rDNA F2nR2扩增片段进行相关候选种(‘CandidatusPhytoplasma’species)的确定及基于17种限制性内切酶的虚拟RFLP图谱及相似系数(similarity coefficient，F)的16Sr组/亚组的确定，iPhyClassifier将序列相似性<97.5%以及RFLP模型相似系数F≤0.85的序列划分为不同的组，0.85

2 结果与分析

2.1 感病植株的症状 感病植株和健康植株明显不同，表现为植原体病害典型的丛枝和小叶症状，丛枝状枝条大量密集丛生，远看呈“鸟窝状”，且节间缩短，叶片卷曲畸形、变小和黄化(图1)。

2.2 羽脉山黄麻丛枝病病害调查 羽脉山黄麻在云南玉溪各县广泛存在，据前期调查发现云南玉溪新平县和峨山县都有羽脉山黄麻丛枝病的发生。新平县发生区域主要位于哀牢山自然风景保护区东侧至新平彝族傣族自治县干热河谷地带，沿省道S306大约45 km 范围内，从表1可以看出具体地理坐标在101°35′—101°53′E和23°56′—24°20′N之间，海拔从1 426～488 m，但发病区域主要集中在低海拔600～400 m之间，发病区域植被较为茂盛。该处山黄麻近3年都发现有丛枝病发生， 2018年7月调查此丛枝病平均发病率为38.9%，危害程度以中度(++)为主，发病树枝症状明显，严重影响植物的生长。该区域接近新平县最低海拔，属于河谷高温区，由此可知，高温地区可能有利于植原体病害的发生。

表1 羽脉山黄麻丛枝病调查区域地理位置及其发病率①Tab.1 Geographical location of survey area and incidence of Trema levigata witches’-broom disease

2.3 16S rDNA 片段 PCR 扩增结果 分别以山黄麻健康和感病植株提取的总 DNA 为模板，经巢式 PCR 扩增，结果感病植株获得约1 200 kb 的16S rDNA 片段，健康植株未扩出特异性条带(图2)，说明感病植株中含有植原体，将该株系命名为云南玉溪羽脉山黄麻丛枝植原体(Tremalevigatawitches’-broom phytoplasma，TLWBYN01)。

图2 山黄麻丛枝植原体16S rDNA 巢式PCR扩增电泳检测Fig. 2 PCR products of 16S rDNA amplified from Trema levigata witches’-broom disease plantsM： 2 000 bp maker； 1-3： 感病植株； 4： 健康植株。Lane 1-3: Diseased plants; Lane 4: Healthy plant.

2.4 16S rDNA序列分析及系统进化树构建 将扩增到的约1 200 bp大小的16S rDNA特异片段克隆测序，结果表明： 该16S rDNA基因扩增片段含有1 246个核苷酸，G + C 的含量为47.11%，TLWBYN01在GenBank中登录号为： MN513329。利用GenBank 中的BLAST程序对所得16S rDNA序列进行同源性检索，发现该序列与植原体16S rDNA序列相似度最高。通过植原体在线分类软件iPhyClassifier得出TLWBYN01与翠菊黄化植原体(CandidatusPhytoplasma asteris，M30790)序列相似性达99.8%，因此该植原体为‘CandidatusPhytoplasma asteris’相关菌株，属于16Sr I组成员。通过MegaX软件构建TLWBYN01的16S rDNA系统进化树(图3)，从进化树可看出TLWBYN01与16S rI组明显聚为一个分枝，属16S rI组成员。通过iPhyClassifier虚拟RFLP分析及相似系数(similarity coefficient，F)计算可知TLWBYN01与16S rI-X亚组的参考株系番木瓜束顶植原体(JF781308)最为相似，相似系数F为0.98。由图4可知，TLWBYN01与16S rI-X(JF781308)的17种限制性内切酶的酶切图谱除了MseI以外其余相同。因此TLWBYN01属于16S rI-X亚组的一个变种16S rI-X**。此外，通过在线分析软件MUSCLE比较得出TLWBYN01与16S rI-X亚组成员番木瓜束顶植原体(JF781308)和印度葫芦植原体(LT594117、LT594118)同源性分别为99.2%和99.6%。

图3 利用邻接法构建的基于16S rRNA基因的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree constructed using the neighbour-joining method based on 16S rRNA gene sequences草莓果变绿Strawberry phylloid fruit;三叶草变叶Clover phyllody;翠菊黄化丛枝AY Witche’s broom;杜鹃花小叶Azalea little leaf; 月见草绿化Oenothera virescence; 墨西哥马铃薯紫顶Mexican potato purple top; 葫芦黄化小叶Lagenaria siceraria yellow little leaf; 番木瓜束顶Papaya bunchy top; 植原体候选种Ca.phytoplasma.

图4 虚拟16S rDNA-RFLP酶切图谱Fig. 4 Virtual RFLP analyses of TLWBYN01 phytoplasmas 16S rDNA F2nR2 fragmentA、B: TLWBYN01和JF781308的17种限制性内切酶虚拟RFLP分析；C：16S rI亚组MseI虚拟RFLP分析。A,B:Virtual RFLP analysis of TLWBYN01 and JF781308 with 17 restriction enzymes. C: Virtual RFLP analysis of 16S rI subgroups with restriction enzymes MseI.

3 讨论

本研究发现的植原体病害寄主为榆科山黄麻属植物羽脉山黄麻，榆科榆属植物已有植原体病害相关报道(朱天生等， 2008)，但榆科山黄麻属植物还未见有关植原体病害的报道，因此羽脉山黄麻为植原体的又一新寄主。羽脉山黄麻丛枝病发生于云南新平县境内哀牢山自然风景保护区东侧的干热河谷地带，海拔1 500 m以下，发病主要集中在400～600 m的低海拔高温地区，且连续3年都观察到该病的发生，症状较为明显，严重影响植物生长，有的甚至整株枯死， 2018年7月调查得知其平均发病率为38.9%，危害程度中度。说明此植原体病害在该区域可能是一种常发病害，加之此处山黄麻分布较为广泛，在条件适宜的情况下，该病害可能会扩散，山黄麻属于绿化先锋物种，应给予一定保护，使其避免受病害危害。前期有研究表明植原体病害的发病与温度相关，温度高容易引发植原体病害，且在温度较高的7、8月份是病害高发期(范国权等， 2015)，本次调查与前期研究相符。此外先前在云南元谋发现的多种植原体病害(万琼莲， 2017)，也位于南亚热带干热季风气候地区，年平均气温相对较高，说明高温有利于植原体病害的发生。

本研究基于16S rRNA基因明确了羽脉山黄麻丛枝植原体(TLWBYN01)的分类地位，该植原体与CandidatusPhytoplasma asteris相关，属16S rI-X亚组的变种，与已报道的榆科榆属相关植原体(16S rV-A)不同(Leeetal., 2004； 朱天生等， 2008)。已知全世界范围内分布最为广泛的是翠菊黄化组(16S rI组)植原体，16S rI组也是我国最主要的植原体之一，组内多样性也最为丰富(Leeetal.， 2004； 赖帆等， 2008)，但有关16S rI-X亚组的序列报道还相对较少，因此本研究可为本亚组及16S rI组的研究奠定基础。植原体不同于其他可培养细菌，它还需要大量数据来进行进一步的分析和完善，这对于植原体的研究具有重要意义。除了分析羽脉山黄麻植原体16S rRNA 基因序列，还可以进一步分析它的其他保守基因，因为相较16S rRNA 基因，其他基因有更大的变异性，有利于植原体的系统分析和鉴定。最早是针对rp、tuf和secY基因对各组植原体进行更细致地划分(朱天生等， 2007)，而后还加入了secA、ipt、dnaK、fusA、gyrB、pyrG和rpoB等基因，得到多个基因序列后，采用多位点序列分析法对组内的植原体进行更为全面的遗传变异规律和系统发育的研究，这在16S rI组内已得到应用(Yuetal.， 2017)。这是首次在羽脉山黄麻上发现植原体，且该丛枝病发生稳定，有一定的发病群体，值得进一步研究，后续可通过多位点序列分析法对其进行完善。在调查过程中也有发现疑似媒介昆虫叶蝉，因此可以进一步调查其媒介昆虫。对该病害的研究，可帮助我们了解植原体以及它与寄主之间的相互关系。

4 结论

云南玉溪新平县发现的羽脉山黄麻丛枝病对植物生长产生了严重影响，经调查表明该病害位于大约101°35′—101°53′E和23°56′—24°20′N之间，集中在低海拔400～600 m的温度相对较高的干热河谷地区，常年危害， 2018年7月调查得知平均发病率为38.9%，危害程度中等，但因该区域植被茂盛，山黄麻分布广泛又是先锋物种，因此要注意进行动态监测，加强对该病害的防控，以免扩散传播。羽脉山黄麻丛枝病经分子鉴定属于植原体病害，该植原体与CandidatusPhytoplasma asteris相关，属16S rI-X亚组的变种。山黄麻为植原体新寄主。