美蔷薇花粉离体萌发条件及贮藏特性研究

宋 华， 朱 莹， 邓 莲， 杜 莹， 刘 娜

(北京市植物园，北京市花卉园艺工程技术研究中心，城乡生态环境北京实验室， 北京 100093)

利用耐寒性强的蔷薇与现代月季进行远缘杂交，是培育耐寒月季的主要途径之一。美蔷薇(Rosabella)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)灌木，为中国特有种，在北方多个地区均有分布，自然分布海拔可达1 700 m[1]，是蔷薇属优良的耐寒种质资源。有研究指出，美蔷薇与现代月季杂交亲和性较强[2]，可作为培育优良耐寒月季的亲本。由于目前美蔷薇尚未在园林绿化中大量栽培利用，其自然分布多在山区且花期较晚，因此，在利用自然分布的美蔷薇为父本与现代月季进行远缘杂交时，需将其花粉贮藏至第二年使用。经过长期贮藏后，花粉能否保持较高活力是杂交成败的关键。

花粉贮藏过程中，生活力受到贮藏温度、湿度等外界因素的影响。一般认为，蔷薇属植物花粉常温保存时间较短，活力保持不足一个月[3-4]。低温低湿的贮藏条件更利于花粉保存。超低温保存可以大大延长花粉的保存时间[5]，但需要特殊的设备。-20 ℃冷冻保存是节约能源、简便易行的贮藏条件。有研究指出，某些月季品种花粉在-20 ℃冷冻保存，活力可以维持一年以上，而且在190 d内，与在-80 ℃保存的活力差异不大[6]。蔷薇属不同种(品种)间花粉贮藏特性差异较大[6-7]，关于美蔷薇花粉贮藏特性的研究未见报道。

花粉离体培养法接近花粉自然萌发状况，是测定花粉生活力的常用方法之一。花粉离体萌发受蔗糖、钙、硼、生长素等多种因素的影响[8]。蔷薇属不同种(品种)花粉适宜的培养基不同[9-11]，美蔷薇花粉萌发的相关研究较少。本试验拟筛选美蔷薇花粉萌发的最适培养基，并研究不同干燥剂及贮藏温度对美蔷薇花粉活力的影响，以探索美蔷薇花粉长期贮藏特性，为其在月季远缘杂交育种中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

美蔷薇(RosabellaRehder & E. H. Wilson)花粉于2017年6月19日采自北京市门头沟区灵山，09：30—10：30时收集即将开放的花苞，13：00时用镊子将花苞内的花药取下，所有花药混合后，置于硫酸纸上，室温条件下(25 ℃，相对湿度为30%～40%)干燥约20 h，收集花粉用于花粉离体萌发测定及贮藏试验。

1.2 试验方法

1.2.1花粉萌发最佳培养基的筛选

选用L16(45)正交试验，各因子水平见表1，各处理重复3次，每重复观察3个视野，每个视野花粉总数不少于50粒，统计花粉萌发率及花粉管长度。

表1 正交试验设计

1.2.2花粉贮藏方法及活力检测

将美蔷薇花粉分成小份，每份约2 mg，用硫酸纸包好。一部分放入装有硅胶或有无水氯化钙的离心管中，置于4 ℃冷藏保存，贮藏90 d、180 d、270 d时各取出1管进行花粉活力测定；另一部分放入不加干燥剂的离心管中，分别置于4 ℃和-20 ℃保存，贮藏90 d、180 d、270 d、360 d、450 d、540 d、630 d时，各取出1管进行花粉活力测定。以筛选出的最佳花粉萌发培养基进行花粉培养，各处理重复3次，每重复观察3个视野，每个视野花粉总数不少于50粒，统计花粉萌发率。

1.2.3花粉萌发率及花粉管长度的测定

花粉培养参考赵宏波等[12]的方法并稍有改动，用吸管吸取一定量的培养液滴在载玻片上，用毛笔把花粉均匀地散在培养基上，将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿中，室温条件下培养6 h后用Olympus CX 31显微镜观察并用摄像系统截取图片。

花粉离体萌发以花粉管长于花粉直径为标准。

花粉萌发率(%)=(视野内萌发的花粉数/视野内的花粉总数)×100%。

使用ImageJ图像处理系统进行花粉管长度测量，每个处理每个重复随机选择10根花粉管测量；萌发数量不足10根的测量所有花粉管长度。

1.2.4杂交授粉方法

2018年5月13日，在北京市植物园月季育种基地进行杂交授粉。母本选用“金奖章”(R.‘Gold Medal’)及“粉后”(R.‘Queen Elizabeth’)2个月季品种，各挑选50朵即将开放的花苞，用镊子小心地把雄蕊去除，套袋。2018年5月14日，用毛笔将贮藏的美蔷薇花粉轻刷在母本柱头上，套袋。2018年10月8日统计各杂交组合的结实率及单果种子数。

结实率(%)=(结实数/授粉数) ×100%;

单果种子数(粒)=收获的种子总数/结实数。

1.3 数据处理

采用SPSS 16.0软件进行数据分析；用OriginPro 9.1软件进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 不同因子对美蔷薇花粉萌发的影响

对正交试验结果进行主效应分析可知(表2、表3)，蔗糖、H3BO3、CaCl2、MgSO4·7 H2O、KNO3等5因子对美蔷薇花粉萌发率及花粉管长度均有极显著影响(p<0.01)。按影响大小排序，影响花粉萌发率的因子依次为CaCl2>蔗糖>MgSO4·7 H2O>KNO3>H3BO3(表2)，即CaCl2对美蔷薇花粉萌发率影响最大，其次为蔗糖；影响花粉管长度的因子依次为CaCl2>蔗糖>KNO3>MgSO4·7 H2O>H3BO3(表3)。

表2 影响花粉萌发率的主效应分析

表3 影响花粉管长度的主效应分析

正交试验均值(表4)表明，不同因子对花粉萌发的影响规律不完全相同。蔗糖浓度较低时(50～100 g·L-1)，随着蔗糖浓度的增加，美蔷薇花粉萌发率及花粉管长度均逐渐升高；浓度为100 g·L-1时花粉萌发率为19.00%，是蔗糖浓度为50 g·L-1时的3.2倍；花粉管长度为88.80 μm，是蔗糖浓度为50 g·L-1时的1.73倍；蔗糖浓度超过100 g·L-1时，花粉萌发率及花粉管长度随蔗糖浓度的增加而逐渐下降，蔗糖浓度为200 g·L-1时花粉萌发率及花粉管长度均为最低；说明蔗糖最佳浓度为100 g·L-1，过高或过低均不利于美蔷薇花粉萌发。不添加H3BO3时花粉萌发率较低、花粉管长度较短，分别为7.31%及41.53 μm；添加0.1 g·L-1H3BO3时，花粉萌发率及花粉管长度显著提高至14.26%和67.23 μm；H3BO3浓度高于0.1 g·L-1时，花粉萌发率显著降低；说明H3BO3最佳浓度为0.1 g·L-1，过高或过低均不利于美蔷薇花粉萌发。不添加CaCl2时花粉萌发率为18.45%、花粉管长度为90.43 μm，显著高于其他水平；CaCl2浓度为0.1 g·L-1时花粉萌发率及花粉管长度显著降低，分别为10.09%和56.55 μm，说明添加CaCl2不利于美蔷薇花粉萌发。MgSO4·7 H2O、KNO3对美蔷薇花粉萌发率的影响趋势类似，不添加MgSO4·7 H2O或KNO3时，花粉萌发率最低，随着浓度的增加花粉萌发率显著提高，较高浓度(0.2 g·L-1、0.3 g·L-1)时花粉萌发率无显著差异；花粉管长度变化趋势与花粉萌发率不同，虽然MgSO4·7 H2O浓度为0.3 g·L-1时、KNO3浓度为0.2 g·L-1时花粉管长度显著高于其他水平，但在低浓度时，花粉管长度没有随浓度的增加而上升，MgSO4·7 H2O浓度为0.2 g·L-1、KNO3浓度为0.1 g·L-1时花粉管长度出现了显著下降。

表4 不同因子水平对美蔷薇花粉萌发率和花粉管长度的影响

2.2 不同营养成分组配对美蔷薇花粉萌发的影响

综合考虑花粉萌发率及花粉管长度(表4)可知，不同因子的最佳水平分别为：蔗糖为100 g·L-1，H3BO3为0.1 g·L-1，CaCl2为0，MgSO4·7 H2O为0.3 g·L-1，KNO3为0.2 g·L-1。这与正交试验中的6号处理的培养基配比吻合(表1)。在正交试验16个处理中，6号处理的花粉萌发率为40.26%、花粉管长度为166.77 μm，均显著高于其他处理(表5)。因此可以推断，美蔷薇花粉萌发最佳培养基为6号培养基，即10%蔗糖+0.1 g·L-1H3BO3+0.3 g·L-1MgSO4·7 H2O+0.2 g·L-1KNO3。

表5 美蔷薇花粉在正交试验中的萌发率及花粉管长度

2.3 不同干燥剂对花粉活力的影响

4 ℃贮藏温度下，无论是否使用干燥剂，美蔷薇花粉活力都随着贮藏时间的延长而降低(图1)。贮藏90 d时，使用无水氯化钙干燥剂的花粉萌发率最低，为27.33%；ck的花粉萌发率最高，为33.00%。贮藏180 d时，使用无水氯化钙干燥剂的花粉萌发率较高，15.54%的花粉具有活力；使用硅胶干燥剂和ck的花粉活力较低，萌发率分别为11.50%和11.24%。方差分析表明，不同处理间的花粉萌发率无显著差异，说明使用干燥剂并不能显著延缓花粉活力的降低；无论是否使用干燥剂，4 ℃贮藏270 d时美蔷薇花粉萌发率均低于10%。

图1 不同干燥剂对美蔷薇贮藏花粉活力的影响(p<0.05)Fig.1 Effects of different desiccant on pollen viability of Rosa bella pollen in storage(p<0.05)

2.4 不同贮藏温度对花粉活力的影响

美蔷薇花粉活力随着贮藏时间的延长而下降，但不同温度贮藏的花粉寿命不同(图2)。4 ℃贮藏90 d时，花粉萌发率为33.00%；贮藏180 d时，花粉萌发率迅速降低，为11.33%；贮藏270 d时花粉萌发率低于10%；贮藏360 d的花粉不再萌发，失去活力。-20 ℃冷冻的花粉贮藏前期(90～270 d)活力下降较为缓慢，贮藏270 d时，花粉萌发率为32.71%，与新鲜花粉相比，萌发率仅降低了20.2%；贮藏270 d后，花粉萌发率迅速下降，贮藏360 d时花粉萌发率为19.88%，为新鲜花粉萌发率的48.5%；贮藏450 d时花粉萌发率不足10%；贮藏540 d时花粉萌发率为3.04%，基本丧失活力。-20 ℃更利于花粉长期保存。

图2 不同贮藏时间不同贮藏温度对美蔷薇花粉活力的影响Fig.2 Effects of different storage times and temperatures on the vigor of Rosa bella pollen

2.5 利用杂交育种验证贮藏花粉活力

利用贮藏330 d的美蔷薇花粉与月季品种进行人工授粉，结果(表6)表明，4 ℃贮藏330 d的花粉与月季品种杂交后不能结实，花粉已失去活力。-20 ℃贮藏330 d的花粉与2个月季品种杂交后均可以结实，结实率均超过50%；美蔷薇贮藏花粉与“粉后”及“金奖章”的杂交单果种子数分别为8.45粒和1.38粒。说明-20 ℃不添加干燥剂贮藏330 d的花粉具有活力，应用于月季杂交育种中是可行的。

表6 美蔷薇花粉贮藏330 d后在杂交中的结实情况

3 结论与讨论

花粉离体萌发受蔗糖、钙、硼、生长素等多种因素的影响[8]。本研究中，蔗糖、钙、硼、镁、钾等5因子均对美蔷薇花粉萌发率及花粉管伸长有显著影响。适宜美蔷薇花粉萌发的蔗糖浓度为100 g·L-1，与单瓣黄刺玫花粉萌发研究结果一致[13]；也有研究认为，5%～8%[14]、15%[15]或20%[9]的蔗糖溶液更利于蔷薇属植物花粉的萌发，这种差异应该是由不同种类植物的花粉萌发特性差异导致。低浓度的H3BO3(0.1 g·L-1)显著促进美蔷薇花粉萌发，与王泽翻等[13]、王岚岚等[16]的研究结果相似。一般认为外源Ca2+可以促进花粉萌发[17]，但本研究结果表明，添加CaCl2不利于美蔷薇花粉萌发，与短梗冬青花粉萌发条件[18]一致。镁和钾是植物体内重要元素，对油茶花粉萌发有明显的促进作用[19]，但对核桃[17]和某些月季品种[16]花粉萌发没有显著影响。本研究结果显示，高浓度的MgSO4·7 H2O或KNO3(0.2～0.3 g·L-1)可显著提高花粉萌发率及花粉管长度；但MgSO4·7 H2O或KNO3浓度低于0.2 g·L-1时，花粉管长度并不随浓度变化呈规律性变化，可能由于钙或蔗糖对花粉管的伸长影响更大，且本研究未考虑不同因子间的交互作用，具体原因有待进一步研究。

适宜的花粉贮藏方法可以延长花粉寿命。有研究表明，比较干燥的环境(相对湿度30%～40%)中代谢过程减弱和呼吸作用降低，能够较长时间保持花粉的活力[20]。本研究中，2种干燥剂不能显著延缓美蔷薇花粉活力的降低，可能由于花粉收集干燥时室内空气相对湿度较低，花粉贮藏时已较为干燥，所以干燥剂的使用对花粉活力变化影响不大。本研究结果表明，贮藏温度是影响花粉长期保存的主要因素，-20 ℃冷冻贮藏利于美蔷薇花粉的长期保存，花粉活力可以保持一年以上，与Giovannini等[6]研究结果一致。

本研究中，美蔷薇花粉萌发率偏低，最高萌发率为40.26%，显著低于平阴玫瑰品种新鲜花粉萌发率(80%以上)[21]。一方面，花粉离体萌发受培养组分、培养温度[17]、pH值[22]等多方面影响，具体萌发条件还需进一步优化。另一方面，花发育时期也是影响花粉活力的重要因素[15]，本研究中为了保证花粉纯度，选择收集的花苞均未开放，花粉萌发率偏低是否受花发育时期影响还需进一步研究。