金毛耳草中熊果酸和齐墩果酸的含量测定

崔 田

(安徽省蚌埠市食品药品检验中心,蚌埠 233000)

金毛耳草为茜草科植物金毛耳草Hedyotischrysotricha(Palib.)Merr.的干燥全草，又名黄毛耳草，味苦，性凉，归肝、胆、膀胱、大肠经，具有清热解毒、利湿消肿的功效，用于肠炎、痢疾、急性黄疸型肝炎等[1]；主要成分为车叶草苷、熊果酸、白桦脂酸、齐墩果酸等[1,2]，有文献报道，采用高效液相色谱法测定金毛耳草中槲皮素和芦丁的含量[3-5]，但目前采用HPLC法同时对金毛耳草药材中活性成分熊果酸与齐墩果酸的含量测定未见报道。本实验建立了HPLC法同时测定该药材中熊果酸与齐墩果酸的含量，为该药材的质量控制提供了参考。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，配有DAD检测器；CP225D型十万分之一电子天平、BS210S型万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)。金毛耳草药材经蚌埠市食品药品检验中心张青云副主任中药师鉴定为茜草科植物金毛耳草Hedyotischrysotricha(Palib.)Merr.的干燥全草。熊果酸对照品(批号：110742-201622，纯度：94.7%)，齐墩果酸对照品(批号：110709-201607，纯度：91.7%)，均购自中国食品药品检定研究院，甲醇为色谱纯，水为自制超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:安捷伦ZORBAX SB-Cl8色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流动相:甲醇-0.2%醋酸溶液(88 ∶12),流速:0.8 ml/min,检测波长:210 nm;进样量10 μl;采用外标法进行定量。在上述条件下,齐墩果酸和熊果酸的分离度良好(R=1.64),理论塔板数均大于5 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取熊果酸对照品、齐墩果酸对照品适量,分别精密称定19.85 mg和20.12 mg,分别置10 ml和50 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液(熊果酸浓度为1.879 8 mg/ml,齐墩果酸浓度为0.369 0 mg/ml)。精密量取对照品储备液各1 ml至10 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液(熊果酸浓度为0.187 98 mg/ml,齐墩果酸浓度为0.036 9 mg/ml)。对照品溶液色谱图见图1。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末(过2号筛)0.5 g,置具塞锥形瓶中,精密加入乙醇50 ml,密塞,称定质量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,用少量乙醇洗涤滤渣和滤器,合并滤液,蒸干,残渣加甲醇适量使溶解,转移至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。供试品溶液色谱图见图1。

2.3 线性关系考察

精密吸取熊果酸和齐墩果酸对照品储备液0.2,0.5,1,2,5 ml,分别至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得到不同浓度的系列对照品溶液,按“2.1”色谱条件进样,以对照品浓度为横坐标(x),色谱峰面积为纵坐标(y),熊果酸和齐墩果酸的线性回归方程分别为y=178.54x-4.089 1,r=0.999 4;y=57.353x+20.592,r=0.999 1,结果表明熊果酸、齐墩果酸浓度分别在0.037 6-0.939 9 mg/ml和0.007 4-0.184 5 mg/ml范围内呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

取对照品溶液,按“2.1”色谱条件连续进样6次,得到熊果酸峰面积的RSD值为0.74%,齐墩果酸峰面积的RSD值为1.38%。

2.5 稳定性试验

取同一份供试品溶液,分别于0,2,4,6,8 h下进样测定,得到熊果酸峰面积的RSD值为1.34%,齐墩果酸峰面积的RSD值为1.12%,表明在室温下放置8 h内样品溶液基本稳定。

2.6 重复性试验

取同一编号样品6份,按照“2.2.2”方法制备供试品溶液,按“2.1”色谱条件进样,测定含量,得到熊果酸含量测定结果的RSD值为0.65%,齐墩果酸含量测定结果的RSD值为1.21%。

1.齐墩果酸;2.熊果酸图1 供试品HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatogram of sample solution

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一编号的样品6份,各0.25 g,精密加入熊果酸对照品溶液(浓度为1.879 8 mg/ml)0.3 ml和齐墩果酸对照品溶液(浓度为0.369 0 mg/ml)0.4 ml,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,计算加样回收率。熊果酸和齐墩果酸的平均加样回收率分别为98.61%和97.63%,RSD分别为1.07%和1.13%(见表1和表2)。

表1 熊果酸加样回收率试验结果Table 1 Recovery test results of ursolic acid

表2 齐墩果酸加样回收率试验结果Table 2 Recovery test results of oleanolic acid

2.8 样品测定

取不同产地的金毛耳草药材0.5 g,按照“2.2.2”方法制备供试品溶液,按“2.1”色谱条件进行测定,按外标法分别计算样品中熊果酸与齐墩果酸的含量,结果见表3。

表3 样品含量测定结果 (n=3)Table 3 Determination results (n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

熊果酸与齐墩果酸检测可以用蒸发光检测器也可以用紫外检测器,紫外的灵敏度更高,而二者最大吸收在近紫外区,波长选择很关键,参考相关文献[6-10],最终选择210 nm。由于二者都属于五环三萜类化合物,结构非常相似,因此,选择适合的流动相至关重要。本文查询了相关文献[6-10],比较了甲醇-乙腈-0.05%醋酸铵、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.2%醋酸、甲醇-水等流动相,发现用甲醇-0.2%醋酸溶液(88 ∶12)时,熊果酸与齐墩果酸分离情况比较好,峰形较好,综合考虑作为本实验流动相。降低流速对分离度也有改善,因此选择流速为0.8 ml/min。

3.2 提取条件的选择

参考相关文献[6-10],对供试品的提取方法进行了考察,比较了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等不同溶剂及加热回流、超声提取方法,结果表明,乙醇超声提取效率较高,又简便易行,因此选择乙醇超声作为提取方法。同时对提取时间进行了考查,比较了20,30,40,50 min超声提取的效率,结果显示30 min后含量无明显变化,故选择超声提取30 min。

3.3 样品测定结果分析

从样品含量测定结果看,不同产地的金毛耳草中熊果酸和齐墩果酸含量差别较大,这可能与气候、土壤、采收时间等有关,这需要下阶段进一步具体研究。本文建立的方法简便易行,可操作性强,可为金毛耳草药材质量控制提供一定依据。