二氧化碳气腹环境对裸鼠卵巢癌移植瘤中Beclin1表达的研究*

杨 冬，王丽峰，张 颖，温都苏

1.廉江市人民医院妇科，广东 廉江 524400；2.广东医科大学附属医院妇产科，广东 湛江 524023

腹腔镜手术因其独特的开腹手术不可比拟的优点，在妇科手术领域得到广泛的开展，并逐渐成为主流方式。随着手术医生操作技巧的不断提高、腹腔镜手术器械的日益改善，避免术后因手术原因造成的癌症术后转移成为研究热点。CO2气腹进入视野，部分报道认为CO2气腹可能引发恶性肿瘤的种植性［1］。CO2气腹通过直接的细胞外环境的缺氧及血流动力学方面的影响导致了腹腔内缺血、腹腔局部缺氧［2］。依据Hanly等［3］的研究结果腹膜局部微环境的改变源于腹膜对CO2气体的吸收、腹膜局部免疫力的下降。Nordgren等［4］认为，肿瘤耐受缺氧环境得以繁殖是其存活的根本。部分专家、学者认为，以CO2为气腹介质的腹腔镜通过烟雾化作用、烟囱效应、肿瘤细胞的穿刺孔直接污染等增加盆腹腔恶性肿瘤在肿瘤细胞腹腔内侵袭、转移的风险［5-9］，相应的增加卵巢癌的转移风险［10］。本次试验以裸鼠卵巢癌移植瘤为研究对象，对照标本中自噬基因Beclin1在CO2气腹作用后的变化情况探讨对癌细胞增殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 裸鼠卵巢癌移植瘤标本的获得：将SPF等级BALB／c／nu裸小鼠40只（雌性，7～8周龄），恒温饲养，人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3（购自中国科学院上海生命科学研究细胞库），细胞培养后接种于裸鼠，要求每个裸鼠接种细胞数量一致，饲养成瘤后成瘤。随机分四组：（1）对照组：10只雌性裸鼠鼠；（2）开腹组：10只雌性裸鼠开腹手术维持30 min；（3）气腹0.5 h组：10只雌性裸鼠气腹维持30 min；（4）气腹0.5 h组：10只雌性裸鼠气腹维持30 min。集体处死，收集各组中裸鼠腹腔内生长的移植瘤标本，取标本甲醛固定及80℃冰箱。

1.1.2 主要实验器材：液氮罐、电泳槽、电泳仪、转膜槽、Western blot曝光系统、Eppendorf 5417R冷冻离心机、XW-80A旋涡混合器、凝胶成像分析系统UVPM-20、逆转录PCR仪（Mastercycler gradient）、双目生物显微镜Nikon YS100。

1.1.3 主要试剂：（1）实时荧光定量PCR相关试剂：Total RNA提取试剂、反转录试剂盒、PCR反应试剂盒、Beclin1 PCR引物、无水乙醇、氯仿、DEPC（焦碳酸二乙酯）、异丙醇、琼脂糖等。（2）免疫组化相关试剂：兔抗人Beclin1单克隆抗体（美国Abcam公司）、二步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒、中性树胶、苏木素等均购置于北京中杉金桥生物技术有限公司；柠檬酸二钠、PBS、柠檬酸、二甲苯等。（3）Western blot主要试剂：兔抗人Beclin1单克隆抗体（美国Abcam公司）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司）、组织裂解液、Bradford蛋白定量试剂盒、蛋白Marker、超敏ECL化学发光试剂盒（BeyoECL Plus）、1.0M Tris-Hcl（PH6.8）、1.5M Tris-Hcl（PH8.8）、5×蛋白上样缓冲液、N-N亚甲基双丙烯酰胺、Tris-base、过硫酸铵、SDS、丙烯酰胺、TEMED、甘氨酸等。

1.2 实验方法

图1 裸鼠卵巢癌组织中的RNA琼脂糖凝胶电泳图

图2（上）融曲线；（下）融解峰

图3 扩增曲线

1.2.2 免疫组化：（1）试验操作 对40例标本石蜡固定后行二步法免疫组化检测，一抗选择Beclin1（美Abcam公司1:2 000稀释）。（2）免疫组化结果判断标准Beclin1相应蛋白阳性表达定位于细胞浆中，可被染成浅黄色、棕黄色或是棕褐色。取每张切片中表染色最强的部分，按着色程度进行评分。0分：基本未着色，染色与背景相似；1分：着色浅，染色略高于背景；2分：中度着色，明显高于背景；3分：强染，染成深棕黄色。每张切片随机选取5个200倍镜视野，根据阳性细胞所占比例进行评分，阳性细胞数小于5%者为0，阳性细胞数5%～25%计1分；26%～50%计2分；51%～75%计3分；76%～100%计4分。将以上两种评分相加，积分为0～1分，表示阴性（“—”）；积分为2～3分，表示弱阳性（+）：积分为4～5分，表示中阳性（++）；积分为6～7分，表示强阳性（+++）。

1.2.3 蛋白质免疫印迹（Western Blot）：各组分别提取总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，制备上样，PAGE电泳胶制备根据Beclin1、GAPDH蛋白的分子量（52 kDa、36 kDa）分别选用8%和12%的分离胶和5%的聚丙烯酰胺凝胶（浓缩胶），电泳、转模、免疫印迹。结果采用用AlphaView软件进行灰度值分析，以内参GAPDH的灰度值为标准，目的蛋白所得的灰度值与内参灰度值相比得出相对灰度值，绘制图表。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 RT-PCR结果

Beclin1 mRNA在对照组、开腹组、CO2气腹0.5 h组及CO2气腹1 h组裸鼠卵巢癌移植瘤组织中表达呈递减趋势，且在CO2气腹1 h组下降最为明显（图4）。四组进行单因素方差分析，有统计学差异（P＜0.05）。对照组与开腹组、CO2气腹0.5 h组与CO2气腹1 h组组间两两比较，无统计学差异，而CO2气腹0.5 h或气腹1 h组与对照组或开腹组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图4 Beclin1在四组组织中的相对表达量比较

表1 Beclin1在四组组织中的相对表达量及组间比较结果

2.2 免疫组化结果

2.2.1 HE染色：从40例标本中各取1张石蜡切片进行HE染色，确定所取标本均为卵巢癌组织（图5）。

图5 HE染色（20×）

2.2.2 Beclin1在裸鼠卵巢癌组织中的表达情况：Beclin1在四组裸鼠卵巢癌移植瘤组织中的表达情况见表2、图6。由于各组间阳性表达率差异不明显，本实验选择评分进行统计学分析。从表中可以看出，Beclin1在四组组织中的阳性表达率无明显差别，表达强度评分虽有逐渐下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图6 A:阴性对照（PBS代替一抗）；B：弱阳性表达；C：中阳性表达；D：强阳性表达（20×）

表2 Beclin1蛋白在裸鼠卵巢癌移植瘤组织中的表达情况

2.3 Western blot结果

Beclin1在四组组织中的表达呈逐渐降低，在CO2气腹1 h组下降尤为明显（见图7），单因素方差分析显示四组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；组间两两比较发现，对照组、开腹组之间无统计学差异（P＞0.05）；CO2气腹0.5 h组与CO2气腹1 h组比较无统计学差异（P＜0.05）而CO2气腹0.5 h或气腹1 h组与对照组或开腹组比较均有统计学差异（P＜0.05），与RT-PCR结果一致，见表3。

表3 Beclin1相应蛋白在四组组织中的相对表达量及组间比较结果

图7 Beclin1相应蛋白在四组组织中的相对表达

3 讨论

CO2气腹对术后癌症转移及再发癌症的影响提上日程，体外研究发现，CO2气腹通过上调或下调细胞因子CXCLl2、CXCR4、nm23-H1、MMP-2、VEGF、VEGFR-2等促进卵巢癌的转移［11-13］。而女性生殖系统肿瘤的发生（诸如乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌）中，自噬作为细胞保护机制的缺陷可导致上述肿瘤的发生。癌基因或抑癌基因通过自噬途径改变其活性。CO2气腹的体外模拟环境下自噬的改变对卵巢癌的转移是否促进目前正在进一步的研究当中。部分研究表明，高压力CO2气腹产生的机械性压迫和代谢影响呼吸、循环、消化、神经内分泌等，同时气腹压力的增加可导致肿瘤的种植性转移。

作为自噬的启动蛋白越来越多的证据表明，Beclin1表达可能是自噬的“守门人”。Beclin1通过激活PI3K III/Vps34通路以介导自噬的正性调节，是调控自噬的一个必需的基因。在人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中观察到高频率的Beclin1等位基因的缺失。Liang等［14］的研究表明乳腺癌组织中Beclin1呈低表达或无表达，在人乳腺癌细胞系MCF-7中，Beclin1表达下降，并几乎检测不到。在对卵巢癌的研究中，Laudanski等［15］收集的卵巢癌标本中Beclin1的表达较良性肿瘤中的表达下调。Qu等［16］发现，40%～70%的卵巢癌中有自噬相关基因Beclin1缺失。免疫组化对比研究显示：Beclin1在上皮性卵巢癌中的表达明显低于良性卵巢肿瘤组织和邻近非肿瘤组织段振玲［17］、Shen［18］，同时研究显示其表达水平与卵巢癌的分化程度、组织学分型、FIGO分期呈负相关。

本实验的研究中仅就模拟腹腔镜下的缺血缺氧环境表达其对Beclin1的影响。本实验中：（1）Beclin1在CO2气腹0.5 h组、CO2气腹1 h组的表达量与对照组及相比较差异有统计学意义，因多项研究表明Beclin1属抑癌基因，其表达下调说明肿瘤在CO2气体处理后增殖能力加强。（2）CO2气腹0.5 h组、CO2气腹1 h组中Beclin1的表达两组间比较差异无统计学意义，说明CO2气腹对肿瘤的增殖的影响在Beclin1介导的自噬途径上无明显时间差异性。故CO2气体可通过Beclin1的表达来促进肿瘤细胞的转移。CO2气体造成的缺氧环境可抑制Beclin1的表达，使Beclin1表达降低。

本实验通过检测裸鼠建立的人卵巢癌移植瘤动物模型中自噬相关基因Beclin1的表达情况，并对比CO2气腹作用后Beclin1的表达差异来反应CO2气腹作用后卵巢癌细胞的增殖情况，初步评估CO2气腹通过自噬途径对卵巢癌细胞生长的影响。依据研究结果，本实验认为，CO2气腹可能通过影响Beclin1的表达进而影响自噬的发生，通过下调Beclin1的表达促进卵巢癌细胞的生长、转移，这种影响与CO2气腹作用时间无明显直接联系。

研究缺血、缺氧机制仅作为腹腔镜手术的一部分为临床手术应用提供实验依据，但是否可以通过相应条件的阻断仍需不断的研究。其最终目的在于通过不断研究和改进为腹腔镜手术能够很好地服务于卵巢癌患者提供相关依据及减低术后转移的风险。