植物乳杆菌素plantaricinQ7在牛乳贮藏保鲜中的应用
2021-07-14步雨珊李剑勋易华西刘同杰公丕民王淑梅刘银雪
步雨珊 李剑勋 易华西 刘同杰 公丕民 王淑梅 刘银雪
摘 要： 植物乳杆菌素plantaricin Q7是由植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Q7产生的，其具有广谱抑菌活性的细菌素，有安全、高效、稳定性好等优点.将效价为533 AU?mL-1的植物乳杆菌素Q7添加到牛乳中，探究其在牛乳贮藏过程中的保鲜效果.结果表明：植物乳杆菌素Q7维持了牛乳良好感官，牛乳贮藏第13天时仍没有异味出现，保持乳白色、略带黄色的状态，无分层和沉淀.荧光假单胞菌是牛乳中的优势嗜冷腐败菌.未添加植物乳杆菌素Q7的牛乳中，荧光假单胞菌落数在第7天超出国标规定;添加植物乳杆菌素Q7将延长荧光假单胞菌落数超出国标规定的时间4 d.植物乳杆菌素Q7有效减缓了牛乳酸度的增加速度，降低了牛乳pH值的下降速度.本研究为植物乳杆菌素Q7的开发与应用提供了依据.
关键词： 植物乳杆菌素; 牛乳; 贮藏; 保鲜
中图分类号： TS 252.4 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2021）02-0146-08
Application of plantaricin Q7 in the storage and preservation of milk
BU Yushan1， LI Jianxun1， LIU Yinxue1， LIU Tongjie1， GONG Pimin1，WANG Shumei2*， YI Huaxi1*
（1.College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao 266000， Shandong， China;2.College of Food Engineering， Harbin University， Harbin 150086， Heilongjiang， China）
Abstract： Plantaricin Q7 is a bacteriocin produced byLactobacillus plantarumQ7 with broad-spectrum antibacterial activity.It has the advantages of safety，high efficiency and good stability.In this study，plantaricin Q7 with a titer of 533 AU?mL-1was added to milk to explore its preservation effects in the process of milk storage.The result showed that plantaricin Q7 maintained the good sense of milk.There was no peculiar smell on the 13thday of storage，and the milk remained white and slightly yellow，without stratification and precipitation.Pseudomonas fluorescenswas the dominant psychrophilic spoilage bacteria in milk.Without adding plantaricin Q7，the number ofP.fluorescensin milk exceeded the national standard on the 7thday.After adding plantaricin Q7，the time ofP. fluorescensexceeding the national standard was postponed for 4 days.Plantaricin Q7 effectively slowed down the increase of milk acidity and the decrease of milk pH value.The results provided a basis for the development and application of plantaricin Q7.
Key words： plantaricin; milk; storage; preservation
0 引言
牛乳中含有乳糖、優质蛋白、必需氨基酸、脂溶性维生素、矿物质等，其营养价值丰富且易于吸收，对维持人体健康有着重要作用[1].然而正是由于牛乳高营养的特点，在生产、运输及保藏过程中，微生物容易在其中加速繁殖，从而导致牛乳品质下降[2].为了保证牛乳贮藏过程中的安全性和营养价值，寻找一种方便、安全、有效的防腐策略十分必要.低温保藏是最常见的一种措施，但低温无法抑制嗜冷菌生长，特别是牛乳中的优势腐败菌——荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）在低温时仍可以存活[3]，其产生的蛋白酶及脂肪酶能够耐受高温，即使高温灭菌也无法将其灭活[4].使用防腐剂是食品保鲜的另一项重要策略，其中绿色健康的生物防腐剂认可度更高[5].细菌素是细菌代谢产生的能够发挥抑菌功效的多肽或蛋白质，是目前食品生物防腐领域的研究热点，乳酸链球菌素Nisin应用广泛[6].GAO等[7]探究了清酒乳杆菌C2（Lactobacillus sakeiC2）产生的细菌素sakacin C2对低脂和全脂牛乳中大肠杆菌（Escherichia coli）活性的影响，发现Nisin能够增强sakcin C2的抑菌功效.JIN[8]开发抗菌涂料时发现，在未经聚乳酸和乳酸链球菌素Nisin混合物处理的脱脂牛乳中，单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）生长良好，涂抹聚乳酸和250 mg Nisin后，在3～42 d的整个储存期内完全灭活了脱脂牛乳中的单增李斯特菌，产生了较好的抗菌防腐效果.Nisin虽然安全高效，但只能抑制革兰氏阳性菌生长，却不能杀灭牛乳中荧光假单胞菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌[9].本课题组前期从青海牦牛奶中筛选到一株具有抑菌特性的植物乳杆菌Lactobacillus plantarumQ7，完成了全基因组测序，经分离纯化和结构鉴定，确定其抗菌成分是植物乳杆菌素Q7[10].植物乳杆菌素Q7属于Ⅱ类细菌素，不仅无毒、高效、稳定性强，而且抑菌谱广，对多种革兰氏阳性和阴性菌（单增李斯特菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、志贺氏菌等）均具有明显的抑制效果，可以作为生物防腐剂在牛乳贮藏保鲜中发挥作用.
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌 株
植物乳杆菌Lactobacillus plantarumQ7保存于中国海洋大学食品科学与工程学院功能性乳品与益生菌工程研究室.
荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens CICC23253购自中国工业微生物菌种保藏管理中心.
1.1.2 仪 器
LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、SW-CJ-1D洁净工作台（苏州净化设备有限公司）、DK-98-IIA电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）、LRH-250生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、ZWY-1102C双层恒温培养振荡器（上海智城分析制造有限公司）、TG20KR-D高速冷冻离心机（长沙东旺实验仪器有限公司）、PB-10pH计（赛多利斯仪器有限公司）.
1.1.3 试 剂
MRS肉汤（青岛海博生物技术有限公司）、LB肉汤（青岛海博生物技术有限公司）、LB营养琼脂（青岛海博生物技术有限公司）、酚酞（国药集团化学试剂有限公司）、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）、蒸馏水.
1.2 实验方法
1.2.1 菌株活化
植物乳杆菌Q7以2%（体积分数）的比例接种到MRS肉汤中，在37 ℃培养箱内培养24 h活化;荧光假单胞菌以2%（体积分数）的比例接种到LB肉汤中，在25 ℃振荡培养箱内培养24 h活化，两者均活化两代之后进行实验.
1.2.2 植物乳杆菌素Q7制备
将植物乳杆菌Q7发酵液以8 000 r?min-1的速度离心5 min，除去菌体，获取上清液.用氢氧化钠将上清液调至与蒸馏水pH值一致，然后经0.22 ?m滤膜过滤后进行超滤浓缩处理备用.
1.2.3 牛乳预处理
将牛乳分装完成后在95 ℃恒温水浴锅内灭菌10 min，待其冷却后接入荧光假单胞菌，使菌液在牛乳中的终浓度为1×103CFU?mL-1.实验组牛乳中加入浓缩的植物乳杆菌素Q7，使其在牛乳中的终效价为533 AU?mL-1;对照组加入等量蒸馏水.将处理好的牛乳密封好，储存于4 ℃的冰箱中，每隔1 d取样进行感官、荧光假单胞菌落数、酸度和pH值检测.
1.2.4 牛乳感官评价
由8位培训后的食品专业学生组成感官评价小组，每隔1 d从气味、色泽和组织状态3方面对牛乳评分，评分表制定参照GB 19301—2010[11]，如表1所示.
1.2.5 牛乳中荧光假单胞菌落数测定
牛乳中荧光假单胞菌落数测定参照GB 4789.2—2016[12].每隔1 d取牛乳，使用生理盐水做10倍梯度稀释，在合适的梯度下取100 ?L牛乳稀释液进行涂布，在25 ℃下培养48 h后计数.
1.2.6 牛乳酸度测定
牛乳酸度测定参照GB 5009.239—2016[13].每隔1 d用酚酞作为指示剂，采用滴定法测定牛乳酸度.
1.2.7 牛乳pH值测定
每隔1 d用pH计测定牛乳的pH值.
1.2.8 统计学方法
实验设置3次重复，结果以平均值±标准差表示.
2 结果与讨论
2.1 植物乳杆菌素Q7对牛乳感官特性的影响
2.1.1 植物乳杆菌素Q7对牛乳气味的影响
从图1可以看出，对照组牛乳储存前7天一直有奶香味，没有异味出现，然而从第9天开始出现异味，却仍可以接受，但在第13天时腐败味道较浓，有刺鼻气味.添加植物乳杆菌素Q7后，实验组牛乳储存前7天奶香气浓郁，直到第13天仍没有异味出现，说明植物乳杆菌素Q7对腐败菌生长有一定抑制作用，减缓了细菌将牛乳中乳糖和蛋白类物质分解而产生腐败气味，使牛乳保持香气.
2.1.2 植物乳杆菌素Q7对牛乳色泽的影响
植物乳杆菌素Q7对牛乳色泽的影响如图2所示.对照组牛乳从第9天起色泽变暗，逐渐出现焦黄色，第13天时牛乳颜色发青，在视觉上不可接受.而实验组牛乳在第13天还保持乳白色、略带黄色的状态，说明植物乳杆菌素Q7抑制了荧光假单胞菌的生长，使蛋白酶将牛乳蛋白分解为氨基酸引起褐变的过程得到缓解，从而使牛乳维持乳白色、略带黄色.
2.1.3 植物乳杆菌素Q7对牛乳组织状态的影响
对储存13 d内牛乳的组织状态进行评价，结果如图3所示.对照组牛乳在前3天时组织状态良好，到第7天时均一性略有下降，第11天时有分层现象，第13天在底部已有絮状沉淀.添加了植物乳杆菌素Q7的牛乳在储存前9天保持均匀一致，没有凝块沉淀出现，第13天虽然稍有黏稠，但并没有出现分层、沉淀等.荧光假单胞菌蛋白酶会将牛乳中的酪蛋白分解，使蛋白质失去平衡从而形成沉淀[14]，植物乳杆菌素 Q7的添加一定程度上抑制以上过程的发生，使牛乳保持良好的组织状态.
2.1.4 植物乳杆菌素Q7对牛乳感官的综合影响
根據牛乳的气味、色泽和组织状态，对牛乳的感官进行综合打分，结果如图4所示.比较每天的分值，发现对照组总低于添加植物乳杆菌素Q7组.13 d内添加植物乳杆菌素Q7的牛乳感官总分不低于20分，而未添加细菌素的牛乳从第9天起便低于20分，第13天总分只有8.45分.通过感官评价发现：植物乳杆菌素Q7有助于牛乳在贮藏保鲜过程中维持良好感官.
2.2 植物乳杆菌素Q7对牛乳中荧光假单胞菌落数的影响
GB 19301—2010规定菌落总数低于2×106CFU?mL-1的牛乳符合标准[11].在实验初始，向牛乳中添加1×103CFU?mL-1的荧光假单胞菌.由图5可知：对照组牛乳在储存1 d后荧光假单胞菌落数便超出1×103CFU?mL-1，并且菌落数以较快的速度增加，第7天时超过2×106CFU?mL-1，在第13 d已高达109CFU?mL-1左右.添加了植物乳杆菌素Q7的牛乳在储存第1天和第3天时，由于细菌素对荧光假单胞菌生长有抑制作用，菌落数均低于起始的1×103CFU?mL-1.从第5天起，菌落数开始超过起始接入的荧光假单胞菌数，直到第9天仍低于2×106CFU?mL-1，到第11天时，菌数超过国标规定，但超出范围很小.植物乳杆菌素Q7的添加，使牛乳中荧光假单胞菌的增长速度变慢，除了从第5天到第7天增长速度较快，其余时间菌落数都以较慢的速度增长.从牛乳中荧光假单胞菌落数的变化可以看出：植物乳杆菌素Q7有效地抑制了牛乳中荧光假单胞菌的生长，对牛乳贮藏起到较好的保鲜效果.
2.3 植物乳杆菌素Q7对牛乳酸度的影响
GB 19301—2010规定牛乳酸度为12～18 °T[11].添加植物乳桿菌素Q7后，牛乳酸度变化如图6所示.随着储存天数的增多，细菌不断繁殖从而产酸，使得牛乳的酸度不断增加.13天内添加植物乳杆菌素Q7牛乳的酸度始终低于对照组牛乳的酸度.对照组牛乳的酸度在第5天就已超出国标范围，在第13天时达到35 °T;而添加植物乳杆菌素Q7后，实验组在第9天酸度才超过18 °T，最终达到25 °T.可见植物乳杆菌素Q7可以减慢牛乳酸度的增加，在牛乳贮藏过程中起到保鲜作用.
2.4 植物乳杆菌素Q7对牛乳pH值的影响
植物乳杆菌素Q7对牛乳pH值的影响如图7所示.随着储存天数的延长，牛乳的pH值不断下降.对照组牛乳的pH值从第1天的6.66下降到5.67，而添加植物乳杆菌素Q7后，牛乳的pH值从6.67下降至6.26，虽然pH值依然呈现下降趋势，但是速率明显减慢.这说明植物乳杆菌素Q7可以控制细菌生长，从而抑制产酸，阻止牛乳pH值的快速下降，在牛乳贮藏保鲜中发挥重要作用.
3 结论
本文探究了植物乳杆菌素Q7在牛乳贮藏过程中的保鲜效果.通过对贮藏13 d的牛乳进行气味、色泽和组织状态等感官评价，以及对牛乳中荧光假单胞菌落数、酸度和pH值进行测定，发现添加植物乳杆菌素Q7能保持牛乳的感官品质，抑制牛乳中腐败菌生长，有助于牛乳维持正常酸度和pH值，表明植物乳杆菌素Q7在乳品工业中的应用潜力，为植物乳杆菌素Q7在食品防腐保鲜中的应用提供了依据.
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（责任编辑：顾浩然，冯珍珍）
