牛A型多杀巴氏杆菌的分离鉴定

杜英立，吴翠兰，陆 震，蓝金红★，曾令越，龙爱淑，李 军★，彭 昊

（1.马山县动物疫病预防控制中心 530600；2. 广西兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室 530001；3. 马山县百龙滩镇农业林业和水利站 530618；4. 三江侗族自治县动物疫病预防控制中心 545500）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）是一种人畜共患的革兰氏阴性菌[1]，正常存在于动物的上呼吸道，宿主动物在先天免疫应答受损时(如病毒感染、免疫抑制、应激等)，多杀性巴氏杆菌能够突破扁桃体等机体防御屏障，进入下呼吸道，引起呼吸道疾病和全身感染，临床可见于猪、牛、羊、兔的肺炎，牛和水牛的急性败血症，猪的萎缩性鼻炎和家禽的禽霍乱[2，3]。多杀性巴氏杆菌是引起牛呼吸道疾病综合征的主要病原，病牛表现为咳嗽、喘，精神沉郁、食欲减退、消瘦、呼吸困难等症状。时至今日，该病的发生并未减退，为此，本研究拟对某例病死牛进行病原分离、PCR扩增鉴定和鉴型，并进行药物敏感性、致病性试验，为其防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基、胰蛋白大豆肉汤购自北京陆桥技术股份有限公司；细菌DNA提取试剂盒、2×ES Taq MasterMix等均购自北京康为世纪生物科技有限公司；药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司；PCR仪、凝胶成像仪购自Biorad公司。

1.2 试验动物

体重为18～22 g的10只健康小鼠，购自广西医科大学实验动物中心。

1.3 引物设计

按吴翠兰等方法[4]合成多杀性巴氏杆菌（Pm）、A（B/D/E/F）型多杀性巴氏杆菌（Pm-A、Pm-B、Pm-D、Pm-E、Pm-F）的引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 引物序列信息

1.4 病原的分离鉴定

无菌采取牛肺脏在胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基上进行接种，37℃培养24h后挑取单个菌落进行纯培养，再挑取纯化后的菌落进行生化鉴定和PCR扩增鉴定。

1.5 致病性试验

取10只小白鼠随机分为2组，每组各5只。试验组小鼠的攻毒剂量为0.3 mL/只，对照组则注射等量的生理盐水，同等条件下培养，每天观察小鼠状况。

1.6 药物敏感性试验

采用NCCLS[5]推荐的K-B纸片法，选用阿米卡星、卡那霉素、诺氟沙星等12种抗菌药物进行体外药敏试验。当抑菌圈直径≥15 mm，判断为高敏；15mm＞抑菌圈直径＞10 mm，判断为中敏；抑菌圈直径＜10 mm，判断为耐药。

2 结果

2.1 病原的分离鉴定

病料接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板培养基生长有圆形小菌落。将分离到的菌接种于生化鉴定管，37℃培养24 ～48 h后，该菌能不分解肝糖和乳糖，能分解葡萄糖、吲哚试验为阳性，该生化反应结果与符合多杀性巴氏杆菌的生化特性。以该菌DNA为模板分别进行多杀性巴氏杆菌和多杀性巴氏杆菌不同血清型基因的PCR扩增鉴定，结果显示能扩出456 bp和1048 bp的特异性条带（图1），表明在该菌为A型多杀性巴氏杆菌。

图1 PCR扩增

2.2 致病性试验结果

试验组小鼠接种24 h内全部死亡，而对照组小鼠未见异常。采集死亡小鼠的肺脏等脏器进行分菌，可从死亡小鼠肺中成功分离到A型多杀巴氏杆菌，由此可知，该分离株具有很强的致病性。

2.3 药物敏感性试验结果

本试验共用12种药物对分离到的菌株进行药物敏感性试验，其结果见表2。分离菌对阿米卡星、卡那霉素、诺氟沙星高敏；对氟苯尼考、丁胺卡那、头孢曲松、庆大霉素、四环素中敏；对链霉素、红霉素、环丙沙星、青霉素耐药。

表2 药物敏感性试验结果

3 讨论

多杀性巴氏杆菌可在许多动物和人类中引起急性或慢性感染。近年来，随着广西养牛业的蓬勃发展，牛只调运频繁，牛巴氏杆菌病的流行和发生逐渐增多。本研究从病死牛的肺脏中分离到1株具有致病性的A型多杀巴氏杆菌，对阿米卡星和卡那霉素高敏，对链霉素、红霉素和环丙沙星耐药。

根据荚膜抗原，可将多杀巴氏杆菌分为5个血清型，分别为A型、B型、D型、E型和F型，其中A型和B型的毒力最强，感染动物的死亡率较高[6]。B型是中国牛群以前最流行的荚膜血清型，但近几年来，我国频频报道从病死牛中分离到A型多杀巴氏杆菌[6-9]。牛A型多杀巴氏杆菌病的流行可能是由于目前巴氏杆菌疫苗主要是针对B型，而对A型的保护率差，因此，A型多杀巴氏杆菌疫苗的研究成为热点。朱玲[10]、贺奋义[11]、嵇少泽[12]等均已对A型多杀巴氏杆菌候选疫苗的筛选做了相关性的研究。本研究分离到1株A型多杀巴氏杆菌，为A型疫苗的研制提供实验材料。

药敏试验结果显示，A型多杀巴氏杆菌存在广泛的耐药性。以往青霉素和链霉素是治疗多杀巴氏杆菌病的首选药物，通过本次结果来看，该菌均对青链霉素耐药。耐药菌株的出现，究其原因是药物的不合理使用、耐药基因的传代等[13]。鉴于多重耐药株的出现，现在研究着把研究瞄点转向微生态制剂的研究。微生态制剂可调节微生态失调，保持生态平衡，提高动物的健康水平，达到防病治疗的效果。