基于GC-MS/MS分析加工对古茶树红茶可溶性糖含量的影响

潘 科, 方仕茂, 刘忠英, 杨 婷, 戴宇樵, 田小强, 杨胜全

(1.贵州省农业科学院茶叶研究所，贵州 贵阳 550006；2.沿河土家族自治县 生态茶发展和技术指导中心，贵州 沿河 565300)

古茶树资源因其稀缺性而具有很高的研究和市场开发价值[1].贵州省作为茶树原产地的核心区域，其古茶树资源丰富[2].2017年8月3日，贵州省人大常委会审议通过了《贵州省古茶树保护条例》，条例定义古茶树是贵州省行政区域内树龄达100年以上的原生地天然生长和栽培型茶树.研究表明，古茶树的特征代谢物与选育无性系茶树有一定差异[3-4]，其中，可溶性糖作为贡献茶叶风味品质的重要特征代谢物之一[5]，直接参与茶汤甜味品质的形成，以及作为美拉德反应基质参与香气的形成[6-8].但目前对古茶树可溶性糖的代谢特征尚不清楚.通过加工可改变茶叶的次生代谢物，尤其是多酚类和游离氨基酸类物质的组成与含量，进而影响茶叶的风味品质[9-10]，明确加工对于茶叶中可溶性糖的影响，可进一步增进对茶叶风味品质的认识.然而，目前对于可溶性糖的检测主要采用液相配备蒸发光散射检测器或示差折光检测器，少数以传统的比色法进行测定，而这类检测大都聚焦于总糖含量分析，对茶叶中可溶性糖的具体组分定性定量分析较少[11].气相色谱—串联质谱(gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC-MS/MS)具有较高的灵敏度，能有效地对茶叶中的可溶性糖组分进行分离和定性定量分析[12].基于此，本研究采用GC-MS/MS靶标分析古茶树不同叶(树)型中可溶性糖的积累及加工对红茶可溶性糖含量的影响，同时，结合感官审评分析，以探究可溶性糖类物质对茶汤甜味品质的潜在贡献.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 古茶树鲜叶采自贵州省沿河县，采集时间为2020年4月1—17日.一芽二叶大叶种乔木型古茶树位于后坪乡和客田镇；一芽二叶中小叶种灌木型古茶树位于塘坝镇和新景镇.

1.1.2 仪器与试剂 仪器包括7890B-7000D气相色谱质谱—质谱联用仪(美国Agilent公司)、5424R离心机(Eppendorf公司)、MM400 球磨仪(Retsch公司)、AS60/220.R2电子天平(RADWAG公司)、CentriVap冷冻干燥机(LABCONCO公司)、MIX-200多管涡旋振荡器(上海净信)、KQ5200E超声清洗仪(昆山舒美)、DHG-9055A烘箱(上海合恒仪器设备有限公司)、XD-DCY-24Y氮吹仪(上海析达仪器有限公司).

甲醇、异丙醇均为色谱级，购买于Merck公司；三氟乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷，99%)购买于Aladdin公司；甲氧铵盐(99%)、吡啶(99%)购买于Sigma-Aldrich公司；正己烷(色谱级)购买于CNW公司；10种糖标准品(色谱级)购买于CNW、IsoReag、TCI 3家公司.

1.2 原料处理

取15份古茶树鲜叶，每份450 g，并均匀分装成3份，用铝箔纸包裹，置于液氮中浸没5 min，随后转入干冰中暂存，最终转置-80℃冰箱保存直至研磨.鲜叶加入液氮研磨，真空冷冻干燥45 h.鲜叶经萎凋、揉捻、发酵、干燥等工序加工成红茶.取13份红茶，每份250 g，并均匀分装成3份，用于感官审评和检测分析.检测样品均经过研磨，过40目筛.

1.3 样品前处理

将冷冻干燥的鲜叶研磨至粉末状.准确称取20 mg茶样粉末，加入甲醇∶异丙醇∶水=3∶3∶2(体积比)的混合液0.5 mL，涡旋3 min，置冰水中超声30 min，随后转至离心机中于4 ℃、14 000 r·min-1离心3 min.吸取50 μL上清液，加入20 μL内标，混匀器混匀后利用氮吹仪进行氮吹，最后将氮吹浓缩液进行冷冻干燥.向收集的冷冻干燥样品中加入100 μL 15 mg·mL-1甲氧铵盐与吡啶的混合液，于37 ℃孵育2 h，随后加入100 μL三氟乙酰胺，再于37 ℃孵育0.5 h，获得衍生化溶液.将正己烷稀释衍生液保存于棕色进样瓶中，用于GC-MS/MS检测.

1.4 可溶性糖的分离检测条件

色谱条件：进样3 μL，1 mL·min-1的氦气在分流比为3∶1的分流条件下将样品载入DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)进行分离.柱温箱升温程序：170 ℃保持2 min，以10 ℃·min-1升至240 ℃，再以5 ℃·min-1升至280 ℃，最后以25 ℃·min-1升至310 ℃，并保持4 min.质谱条件：传输线温度240 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电离电压70 eV.扫描模式为选择离子监测模式.

1.5 可溶性糖的定性定量方法

采用Afilent MassHunter定性定量软件进行数据处理，以12种糖化合物混合标准溶液作为质控样本，在仪器分析过程中，每隔 10个检测分析样本插入一个质控样本，通过对同一质控样本的质谱检测分析的总离子流色谱图进行重叠分析，判断样品检测期间仪器的稳定性.

1.6 数据处理

采用Excel、SPSS 25和Origin 2017 64Bit软件实现数据处理和图表可视化.

2 结果与分析

2.1 检出的可溶性糖组分及其含量

基于GC-MS/MS实现12种可溶性糖的分离(附件图Ⅰ，扫OSID码可见).在古茶树鲜叶和红茶中共检测出10种可溶性糖.其中，3种为二糖，分别是蔗糖、麦芽糖、海藻糖；7种为单糖，分别是D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-果糖、D-半乳糖、葡萄糖、D-山梨醇；而乳糖和木糖醇未检出.表1显示：在检测出的可溶性糖中，大叶种和中小叶种鲜叶均以蔗糖含量最高，分别为(35.18±5.36)、(9.77±3.90) mg·g-1，其次为葡萄糖和D-果糖含量，葡萄糖含量分别为(6.77±2.21)、(1.61±0.57) mg·g-1，D-果糖含量分别为(4.45±2.01)、(0.73±0.55) mg·g-1.在红茶中，大叶种的D-果糖含量最高，为(7.44±1.37) mg·g-1，其次为葡萄糖含量(6.91 mg·g-1±1.24 mg·g-1)；中小叶种的葡萄糖含量最高，为(5.06±0.43) mg·g-1，其次为D-果糖含量(3.90 mg·g-1±0.32 mg·g-1).

表1 鲜叶及其所制红茶的可溶性糖含量1)Table 1 Soluble sugar content of fresh tea leaves and dried tea leaves

2.2 不同叶型鲜叶可溶性糖含量的差异

在大叶种和中小叶种的鲜叶中均检测出10种可溶性糖.表1显示，大叶种鲜叶中单糖、二糖和总糖的含量分别为(12.41±3.91)、(35.49±5.36)、(47.01±7.77) mg·g-1，中小叶种的含量分别为(2.55±1.04)、(10.06±3.94)、(12.61±4.89) mg·g-1，单糖、二糖和总糖的含量在两种叶型间均存在显著差异.图1显示，在二糖类物质中，大叶种鲜叶的蔗糖含量极显著大于中小叶种，两种叶型的麦芽糖和海藻糖含量差异不显著.在单糖类物质中，大叶种鲜叶的葡萄糖和D-果糖含量最高，分别为(6.77±2.21)、(4.45±2.01) mg·g-1，其次是D-阿拉伯糖含量(0.14 mg·g-1±0.03 mg·g-1)，其中，大叶种鲜叶的D-果糖、葡萄糖和D-阿拉伯糖含量显著大于中小叶种；中小叶种鲜叶的L-鼠李糖和D-山梨醇含量极显著大于大叶种；两种叶型的L-岩藻糖和D-半乳糖含量差异不显著.

2.3 不同叶型红茶可溶性糖含量的差异

鲜叶加工成红茶后，在大叶种和中小叶种的红茶中均检测出10种可溶性糖，木糖醇和乳糖未检出，此结果与鲜叶的检出结果一致.由表1可知:大叶种和中小叶种红茶的单糖含量分别为(14.82±2.57)、(9.80±0.76) mg·g-1，分别较鲜叶增加了19.42%、284.31%(P<0.001)；二糖含量分别为(1.38±0.37)、(0.59±0.04) mg·g-1，分别较鲜叶减少了96.11%、94.14%(P<0.001)；总糖含量分别为(16.20±2.46)、(10.39±0.73) mg·g-1，分别较鲜叶减少了65.54%、17.61%.图2显示：在大叶种红茶中，D-果糖、葡萄糖和蔗糖的含量均显著大于中小叶种，而D-阿拉伯糖、D-山梨醇、L-鼠李糖、海藻糖和D-半乳糖的含量均小于中小叶种；两种叶型的L-岩藻糖和麦芽糖含量差异不显著.

图1 两种叶型古茶树鲜叶可溶性糖含量的差异Fig.1 Differences on soluble sugar content in ancient tea tree fresh leaves with 2 leaf shapes

2.4 加工工艺对茶叶可溶性糖含量的影响

由表1可知，鲜叶加工成红茶后，两种叶型红茶的单糖含量较鲜叶均显著增加，二糖和总糖含量显著减少.红茶感官审评结果(表2)显示，红茶茶汤的甜醇味与红茶的可溶性糖组分、含量相关.推测古茶树鲜叶经加工后促进二糖水解为单糖，从而增强了红茶的甜醇滋味特征.已有研究表明：红茶加工工艺能有效改善茶汤苦涩味，增加鲜甜度[13-14]；不同加工工艺制成的红茶，其可溶性糖含量存在差异[15]，且这一差异在同一工序不同处理程度也明显不同[16].上述前人研究结果结合本研究结果可以证实，鲜叶加工成红茶后，促进二糖水解为单糖，从而增强了茶汤的甜醇口感.需要指出的是，本研究中的单糖或二糖可能为其他多糖的水解产物；其次，多糖的水解产物也可能在热作用下发生美拉德反应参与茶香的形成，从而导致单糖含量减少[7].具体的糖代谢或参与茶叶香气形成的机理还需进一步研究证明.

图3显示：鲜叶制成红茶后，两种叶型葡萄糖含量的增加程度差异不明显；D-山梨醇、L-岩藻糖和L-鼠李糖含量在加工前后的变化规律不一致.可能原因是由于大叶种鲜叶采自乔木型茶树，单株采样、地理位置和管护水平(如采摘轮次)等因素影响可溶性糖的积累差异所导致[17]，从而使其含量在样品间存在较大差异.该差异对表1中大叶种鲜叶和红茶可溶性糖含量的标准偏差较中小叶种更大做出了合理的解释.

图2 两种叶型古茶树红茶可溶性糖含量的差异Fig.2 Differences on soluble sugar content in ancient tea tree dry tea with 2 leaf shapes

表2 红茶感官审评结果Table 2 Sensory evaluation of dry tea

图3 加工对古茶树茶叶可溶性糖含量的影响Fig.3 Effect of processing on soluble sugar content of ancient tea tree

3 讨论与结论

3.1 古茶树的鲜叶质量是茶叶品质形成的基础

不同叶型鲜叶可溶性糖含量的差异，是影响古茶树红茶品质的关键.贵州省沿河县有丰富的古茶树资源[2,18].本研究的茶树鲜叶来源于茶种(Camelliasinensisvar.sinensis)和阿萨姆种(Camelliasinensisvar.assamica)，前者为生长较慢、叶片较小，能够承受寒冷气候的灌木，后者为生长较快、叶片较大，对寒冷天气敏感的乔木[19].本研究结果表明：大叶种鲜叶中蔗糖、D-果糖、葡萄糖和总糖的含量均显著大于中小叶种，这在一定程度上反映了鲜叶品质的差异，同时也体现出不同类型茶树在光合作用、呼吸作用和抗逆性等方面的不同[20].红茶感官审评结果表明，大叶种红茶的甜醇味更突出，这可能与大叶种红茶单糖含量较多有关.综上，鲜叶可溶性糖含量的差异是形成红茶甜醇风味品质的重要因素[21].

3.2 加工工艺是茶叶风味品质形成的关键

加工工艺是形成茶叶风味品质的关键[9,22].本研究结果表明，鲜叶制成红茶后，加工促进了二糖(蔗糖)含量减少，单糖(D-果糖、葡萄糖)含量增加，总糖含量减少，这一结果可能与鲜叶经萎凋、揉捻、发酵、干燥等工序处理有关.加工过程中的逆境胁迫或热处理引起多糖向单糖水解的趋势加剧，促进多糖类物质逐渐水解成分子量更小的二糖或单糖等物质[16,20]；另一方面，部分可溶性糖在热作用下与氨基酸等物质发生美拉德反应参与茶香的形成，从而引起可溶性含量减少[6-7].因此，明确加工过程中代谢物的变化规律，采用合理的加工技术对茶叶中代谢物的保留、产生或降解实现有效调控，进而提升茶叶品质.

本研究基于GC-MS/MS分析乔木型和灌木型鲜叶可溶性糖含量的差异，并分析了加工对可溶性糖含量的影响，从代谢物水平揭示了古茶树红茶甜醇滋味的物质基础，为红茶加工提供了参考依据.