气相色谱分析方法开发经验总结

文/ 长征纵横

气相分析方法开发的十二个步骤// 方法开发是个复杂而又神秘的工程，往往需要扎实的理论知识储备，但同时也少不了经验的积累；对于方法开发，需要我们从多学科出发，分析仪器学、色谱学、药学、有机化学、分析化学等学科综合，也需要我们熟练掌握文献信息检索，从中吸取精华，同时不断去试错，下面就把我个人职业生涯的经验进行总结提炼，供同行一起学习探讨。

步骤一、确认主要工作内容

1.残留溶剂检测分析方法：GC-HS方法、GC直接进样方法。

2.基因毒杂质检测分析方法。

3.高沸点样品杂质分离与含量检测方法。

步骤二、信息收集

1.要确定待测物质的溶解性、极性、沸点，主要针对“溶剂残留”。

2.需要确定样品的溶解性、热稳定性、极性、沸点、化学性质（酸碱）、物理属性（固体/液体/半固态）。

3.收集并计算化合物（待测物质）的CH含量%比值，CH含量%比值越高检测灵敏度就越好，反之，CH含量%比值越低检测灵敏度就越差。

步骤三、色谱柱使用选择指南（分离关键）

1.非极性色谱柱：分离主要根据沸点高低，沸点低先出，沸点高后出；同沸点的含有O含有N的极性先出，烃类后出，如：DB-1、HP-1、BP-1、SE-30；

2.极性色谱柱：分离主要根据分子极性大小，极性小先出，极性大后出,如DB-Wax；

3.首选中极性毛细管色谱柱，既能兼顾沸点差异又能兼顾极性差异，如：DB-624、HP-5，表1列举了几种常见色谱柱的极性及使用范围；

表1 常见色谱柱的极性与使用范围

4.色谱柱直径（内径/粒径）越窄/越小，柱效越高，峰展宽越小，峰越尖锐，峰灵敏度越高，增加分离度；

5.色谱柱膜厚影响传质阻力，液膜越薄的传质阻力越小，在同样的线速度下能够获得更高的柱效，柱效越高，峰展宽越小，峰越尖锐，峰灵敏度越高，增加分离度；液膜厚，保留时间延长。

步骤四、进样方法的选择

1.方法有溶液直接进样法、顶空进样法。

①残留溶剂-HS：大多数是低沸点物质（醇/酯/烷烃/醚），90%以上采用顶空进样（GC-HS），清洁进样，基本不出杂峰（溶剂），原料不被破坏但经济费用高。

②残留溶剂-DS：5%及少数采用溶液直接进样（GC-DS），虽然经济，但出杂峰多（主要原料破坏带入），易损坏色谱柱，需清洁老化保护，表2总结了一些方法开发选择需要考虑的方面。

表2 开发选择考虑总结

2.溶剂沸点过高（沸点大于180℃），且样品对热比较稳定，首选溶液直接进样法。

3.溶剂沸点低（沸点小于150℃），且样品对热不稳定，首选顶空进样法。

4.顶空进样法可消除因溶液直接进样会产生降解杂质峰而干扰目标峰（进样口温度大于200℃），采用顶空进样方法还可以减少对样品的预处理。

5.基因毒杂质方法开发，优先选择溶液直接进样法（限度低，主要考虑提高灵敏度）；样品杂质分离选择使用溶液直接进样法。

6.对于基因毒杂质限度小于2 ppm以下方法开发，优先选择GC-MS溶液直接进样法。

7.查看CH含量%比值选择进样方法：

①CH含量%比值高：对于残留溶剂检测选择顶空进样法，对于杂质分离/控制或基因毒杂质控制选择溶液直接进样法时，可开发低浓度供试品溶液。

②CH含量%比值低：对于残留溶剂检测选择溶液直接进样法，对于杂质分离/控制或基因毒杂质控制选择溶液直接进样法时，可开发高浓度供试品溶液。

步骤五、确定定量方法

1.外标法：残留溶剂、含量（准确）。

2.内标法：残留溶剂（主要针对易挥发烷烃类）。

3.面积归一化法：样品杂质分离及纯度。

步骤六、样品预处理方法

1.气相色谱仪能直接分析的样品通常是气体或液体，固体样品在分析前应先溶解在适当的溶剂中，而且还要保证样品中不含GC不能分析的组分（如无机盐：进样口温度不能保证盐汽化），往往会聚集在进样口衬管或分流平板导致污染/堵塞，还有可能通过载气进入色谱柱中，损坏色谱柱的填料。

2.样品预处理/溶解原则：根据相似相溶原理。

3.样品分类：气体样品、液体样品、固体样品。

4.气体/液体样品预处理方法：

①直接进样分析（纯度分析与检测），如：甲烷、乙醇；

②脂溶性液体样品（杂质），通常需要用脂溶性有机溶剂溶解样品，如：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、

DMSO、DMF；

③进样方式：溶液直接进样、顶空进样。

5.固体样品（含盐）样品预处理方法：

①样品性质：易溶于水，难溶于有机溶剂，样品熔点高，难汽化，如：钠盐/钾盐/盐酸盐/硫酸盐/磷酸盐/富马酸盐；

②如果选择水作溶剂-尽量使用顶空进样方法；

③灵敏度不理想且限度低（1~10 ppm）-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法来进行预处理样品，这样既可以使用溶液直接进样又可以使用顶空进样，检测杂质/残留/基因毒通用。

6.固体样品（不含盐）样品预处理方法：根据相似相溶原理。

步骤七、溶剂系统选择

1.如果是溶液直接进样法，优先考虑溶剂选择，溶解样品的溶剂和最大溶解限度；如果是顶空进样法，可根据样品和溶剂都能溶解；

2.原则上水溶性样品优先选择水，非水溶性样品可选择酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC；

3.溶液直接进样-样品溶剂选择考虑：

①化学稳定（水解/醇解），优先选择水（水溶性）/醇/酯（脂溶性）作为溶剂；反之选择烷烃、质子溶剂（万能溶剂：DMF、DMSO、NMP、DMAC）作为溶剂；

②样品具有酸/碱性，但是检测残留溶剂或杂质也具备酸/碱性，可根据待测物质酸/碱性质选择酸碱中和样品；如盐酸/硫酸/富马酸盐等产品检测胺类，需要单独使用碱性溶剂进行中和解离，同样反之，如吡啶/钠/钾盐等产品检测酸类，需要单独使用酸性溶剂进行中和解离，具体溶剂选择需要进行加标回收验证实验。

③供试品溶液要澄清，不与样品及待测物质反应或结合。

4.顶空进样-样品溶剂选择考虑：

①化学稳定（水解/醇解），优先选择水（水溶性）作为溶剂；反之选择质子溶剂（万能溶剂：

DMF、DMSO、NMP、DMAC）；

②样品具有酸/碱性，同上“3.②”。

③样品溶解完全没要求,顶空进样气体（溶剂残留）。

5.对于低限度燃烧值大的物质，可选用盐析溶剂系统，如：苯残留、三氯甲烷。

6.样品溶解溶剂选择，也要考虑残留溶剂的溶解度（如：烷、醚类不溶解水）。

7.大部分溶剂系统优先选择DMSO、NMP、DMF，因为既能溶解样品又能溶解溶剂。

步骤八、柱温开发研究

1.等温：对于溶剂个数少（1~3个），且各溶剂沸点差异不算很大，此时可选择等温法，比如50℃保持10~15分钟，适合残留溶剂检测、基因毒杂质检测、含量测定。

2.程序升温：对于溶剂个数多（大于5个），且各溶剂沸点差异较大，此时可选择程序升温法，比如40℃保持10分钟，以10℃/min速率升至180℃，保持5分钟，适用于产品杂质分离、残留溶剂检测，表3、表4展示了经典的程序升温。

表3 经典程序升温（残留溶剂、杂质分离）

表4 杂质分离的程序升温

3.极端分离：对于大部分沸点低溶剂（当使用DB-624）且考虑分析时长时，可选用低温程序升温法，比如初始温度为35~40℃，分析环境一定要保证温度＜25℃。

步骤九、顶空条件方法选择和研究

1.炉温（加热-顶空瓶平衡温度）：

①以水为溶剂，温度范围选择75~90℃，最高选择90℃；

②以DMSO、DMF等为溶剂，温度范围选择80~145℃，最高选择140℃；温度过高要考虑高温时长导致溶剂反应降解产生新的未知杂峰；

③考虑温度过高有爆瓶危险，特别在使用盐析方法时（因为溶剂系统里有水分存在）爆瓶概率增加；

④加热温度研究最高温度一般低于溶剂10℃（在考虑灵敏度情况下）。

2.定量环温度：温度要大于炉温10℃。

3.传输线温度：温度要大于定量环温度10℃。

4.顶空瓶（加热）平衡时间：根据大部分溶剂沸点，沸点都相对高平衡时间就长，沸点都相对低平衡时间就短；常规平衡时间为30~60分钟，经典平衡时间为30分钟。

十、检测器选用

1.90%分析方法工作优先选用FID检测器：含碳氢化合物。

2.基因毒杂质选用FID-MS检测器。

3.如含电负性基团（F/Cl/Br）且含CH量少，选用ECD电子捕获检测器，如三氯甲烷无H物质。

4.含有非碳氢化合物组分时，且对检测灵敏度要求不高，通常选择TCD检测器，主要是气体检测，如辅材：氮气。

5.其他：N/P（氮/磷）检测器。

步骤十一、方法建立

1.进样口温度：一般选择200~230 ℃，进样口温度要大于传输线温度，可根据样品性质研究选用中高温，如150~180 ℃（考虑样品不被热解）。

2.检测器温度：一般选择230~260℃。检测器温度要大于进样口和色谱柱温度。

3.流速：3.0~5.0 mL/min，经典流速为：4 mL/min和5 mL/min。

4.分流比：①5:1-50:1；②选择规则：响应值高，使用大分流比，反之，则使用小分流比；③经典分流比为5:1（顶空进样）和50：1（溶液直接进样）。

5.进样量：顶空进样为1 mL，溶液直接进样为0.2-1 uL，也可根据进样峰型进行改进。

6.样品浓度/配制开发研究：

①顶空进样：0.2~1 g（根据限度/灵敏度要求进行研究），对于大浓度要考察样品提取平衡；浓度一般控制在0.1~0.4 g/mL（顶空装量控制在1~5 mL）；

②溶液直接进样：一定要考虑溶解完全，浓度可根据限度/灵敏度要求进行开发研究；一般控制在0.5~200 mg/mL；

③开发研究合适的样品浓度，一定要根据杂质限度/灵敏度做相应研究调整。

7.对于杂质分离（溶液直接进样法），在方法开发同时也要考察残留问题，可增加清洗老化色谱柱方法程序，也可增加清洗进样针方法；还有对于对气相管路有吸附残留性质也可增加清洗程序（如胺类、＞150 ℃高沸点物质），增加程序一定要作为分析方法的一部分，且一定要经过验证验收。

8.方法开发时遇到难点：分离度、灵敏度、峰型。

分离度优化研究：

①极性色谱柱与非极性色谱柱的转换使用（DB-Wax与DB-624转换）；

②使用程序升温（速率可低至3~5 ℃/min，但是分析时长增加，灵敏度减小）；

③使用长色谱柱（如30 m→45 m→75 m）；

④使用小粒径色谱柱（3 um→1.8 um→1 um）；

⑤降低流速（变流速如：3→1 mL/min）；

⑥使用程序降温（120→40℃，速率10-20 ℃/min）。

灵敏度优化研究：

①增加进样量（1→2uL）；

②增大流速；

③增加顶空瓶装样量（最大5 mL，可研究6~8 mL）；

④使用小粒径色谱柱（3 um→1.8 um→1 um）；

⑤使用盐析方法（成功典型：苯、三氯甲烷）；

⑥顶空方法：适当增加顶空瓶加热温度和时长（进行对比研究）。

峰型优化研究：

①使用小粒径色谱柱；

②增大柱流量；

③使用专属柱（如胺类分析柱、醇类分析柱）；

④升高柱温。

9.系统干扰考察研究：先走空白2针：样品1针、对照1针，查看空白、样品溶液的干扰情况，空白与样品应无干扰峰出现（方法验证-专属性），且对LOQ和LOD测试无干扰，基本能通过LOQ和LOD验证（方法好坏体现在系统与溶剂对测试的干扰）。

10.系统有干扰可通过换溶剂或调整程序升温来消除对目标峰的干扰。

11.进行LOQ考察：只确认灵敏度（响应值）最小的2个，将LOQ试验出来，LOQ对应浓度是否合格（LOQ含量不得高于限度的50%）。

12.最后进行100%加标回收测试，回收结果如果满足90%~105%，方法基本确定。

步骤十二、分析方法评价与挑战

1.分析方法开发评价标准：

①空白考察：空白溶液无干扰峰出现，应该对测试无影响（最小干扰＜LOD）；

②分离度：最低分离度标准为，各相邻峰间分离度＞2.0（最小1.5）；

③LOQ：确认灵敏度（响应值）最小的2个，将LOQ试验出来，LOQ对应浓度是否合格（LOQ含量不得高于限度的50%），且LOQ的S/N要大于10；

④加标回收标准（90%~110%）；

⑤溶液稳定性：100%加标溶液考察0、2、4、8、24小时的稳定性，主要考察峰面积RSD%（n=5）以及各溶剂的回收率%。

2.分析方法简单预实验（预验证）：

①线性：50%、100%、150%、200%（每点进2针），R大于0.999；

②准 确 度：50%、100%、200%（每点进2针），回收率%应在90%~110%；

③SST实验：6针对照结果，各溶剂峰峰面积RSD%（n=6）均小于6.0%，且考察各溶剂峰的拖尾因子或对称因子（0.9~1.1，最大不可超过2.0）。