低强度超声对斑马鱼胚胎发育的影响

闫延鹏，郑 杰，唐惠兰，崔建国，胡 光

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆400054)

0 引 言

频率超过20 kHz的声波即为超声波，其具有频率高、波长短、方向性好、穿透性强的特点[1]。超声波的生物效应主要包括机械效应、空化效应和热效应等，这些生物效应对生物细胞生长会产生不同程度的影响[2]。超声对细胞的刺激作用及相关机制已有了一定程度的研究，并取得了相应的成果。采用低强度超声(Low-intensity Ultrasound, LIUS)刺激细胞可促进细胞新陈代谢、改善细胞内组织营养、增强再生机能，尤其是对细胞增殖、软骨修复等具有促进作用，临床已证明LIUS可以促进新骨骨折、延迟愈合及骨折不愈合患者的康复[3-4]。已有研究表明，低强度超声可以通过促进细胞的pH值升高[5-6]，促进细胞 Ca2+浓度升高[7-9]，尤其是改变细胞膜的通透性等方式来加快细胞的代谢生长[10-11]，其中声孔效应是改变细胞膜通透性的最直接因素。目前，关于细胞刺激的超声频率选择依据尚无统一标准，也缺乏详细的理论描述，而且相关超声刺激装置多为换能器浸入式方式，结构缺乏严谨性，超声刺激参数调节不便，并缺乏对刺激环境的整体控制和调节。

斑马鱼是研究胚胎发育分子机制的优良资源，是继大鼠、小鼠之后第三重要的脊椎类模式动物，已经被广泛应用于生命科学研究。斑马鱼具有体积小、易养殖、产量大、发育快等特点，适合实验室高通量研究。此外，斑马鱼基因数目有约 30 000个，与人类基因组同源性高，许多基因与人类的基因存在一一对应的关系，是研究外界因素刺激对生物细胞生长发育影响的理想对象。

针对上述情况，本研究选择低强度超声对斑马鱼鱼卵胚胎进行生长刺激研究，通过理论及仿真得到了细胞膜特征频率；同时根据该频率范围设计了一种超声刺激装置，该装置可对细胞刺激环境进行检测与控制，并且能够及时调节超声作用参数；此外，为进一步验证计算结果和装置的作用，设计了正交试验的方案，对超声刺激频率、刺激时间和信号激励电压展开了三因素、三水平的研究，以考察超声装置对斑马鱼鱼卵孵化速度的影响，最终确定了最优方案：在频率为 1.26 MHz，刺激时间为30 min，信号激励电压为3 Vpp的超声条件下，鱼卵孵化指数明显高于对照组。由此证明适当条件的超声刺激可促进斑马鱼的胚胎发育。

1 理论基础

生物细胞的共振频率可由声学振动理论进行推导和计算，对换能器的频率选择在超声刺激细胞的研究实验中具有重要的意义。依据共振吸声理论，当超声波换能器的中心频率达到细胞膜的共振频率时，细胞膜就会发生共振，从而使超声能量最大限度地进入细胞，带来一系列的生理、物理效应，尤其是声孔效应。根据细胞的外形结构可将生物细胞分为圆球形和椭圆球形，故可分为两种形式计算其细胞膜的共振频率。

1.1 圆球形细胞膜的共振频率

1.2 椭球形细胞膜的共振频率

假设椭球细胞膜的长半轴为 a，短半轴为 b，以长轴和短轴建立x-y平面，Z为坐标x和坐标y的函数。借助里兹法解得椭球膜固有振型为[14]

1.3 超声作用下的微泡声孔效应

在超声刺激细胞的过程中，超声带来一系列的生理、物理效应，尤其是声孔效应。声孔效应的出现是引起细胞膜通透性改变的最直接的因素[15]。通透性的改变会促进膜内外物质传输，提高胚胎细胞代谢率，加快细胞生长。声孔效应的本质是在短暂时间内对细胞膜进行精确穿孔，因为高频超声的空化作用会在液体内部产生大小不一的微泡，而处于细胞膜表面的空化微泡的剧烈破裂是引起声孔效应的重要机制之一。在稳态空化时，微气泡的振动可以对附近细胞膜产生微声流，或者微气泡直接对细胞膜产生推拉作用；在瞬态空化时，微气泡膨胀破裂产生冲击波。这些作用可以对细胞膜产生可恢复或不可恢复的开裂，从而改变细胞膜通透性。

不同的细胞，其内部成分及结构会有所差异。但从声学角度分析，细胞可近似为充满液体的球体，其状态方程可用泰特(Tait)方程表示[16]：

其中：B和N为常数；pc为细胞内部的压强；p0为细胞内的参考声压；ρc和ρc,0是细胞内部的压强为pc和p0时的细胞内的流体密度。考虑到胞内含水量高达 80%，故可将细胞近似等同于水，即B=330.9 MPa，N=7.15，。当其他参数(如超声频率)不变时，通过增加超声声压或减小微泡与细胞的间距，会明显引起细胞膜的变形，从而增强声孔效应。

可以通过建立椭圆细胞动力学模型，利用荧光探针来解释超声引起细胞膜通透性改变过程的机理以及对通透性影响的规律。细胞膜内外荧光素物质的进出同时进行，依据质量守恒原则，质量微分方程为[17]

其中：k1为细胞死亡荧光素损失速率常数；k2为荧光素渗入胞内速率常数；k3为荧光素渗出胞外速率常数；E和F分别表示胞内(外)荧光素的浓度。其中F=T-E，(T为胞内外物质渗透总量)。对式(8)求解得到一阶常微分方程的通解：

式(9)为超声作用下细胞膜通透性的动力学模型，其中，k1、k2、k3和T均为定值，与t、E和F无关，与超声强度和频率有关。上述关于细胞膜通透性改变的机制与理论分析，有利于后期超声对细胞发育影响的阐述与说明。

2 超声声场与细胞特征频率的仿真

本文使用仿真软件COMSOL Multiphysics 5.4进行了超声换能器流体域声场及细胞膜特征频率的仿真。该软件可进行多物理场(结构力学、声学、电磁、流体等模块)以及多维组件的仿真，具有仿真准确、使灵活方便的特点。

2.1 细胞特征频率的仿真

细胞膜主要由蛋白质、磷脂和碳水化合物组成，为了方便仿真研究，本文将细胞等同于均匀的球形膜，通过细胞膜各组成成分的平均密度(蛋白质为 1 330 kg·m-3，磷脂为 920 kg·m-3，碳水化合物为 1 200 kg·m-3)，求解均值得到细胞膜的平均密度为 1 080 kg·m-3[14]。细胞膜模型相关参数如表 1所示[18-20]。

表1 细胞膜仿真材料参数Table 1 Simulation material parameters of cell membrane

分别建立圆球形和椭球形细胞模型，通过仿真计算可知，圆球形细胞模型最小特征频率为1.244 MHz，椭球形细胞模型最小特征频率为1.225 4 MHz，为了简化仿真过程，超声高次谐波产生的其余特征频率暂时不予考虑。该特征频率下的细胞模型振型如图1所示。由图1可知，薄膜振型高低交替分布，振型为零的区域为节线[19]。

图1 圆球形和椭球形细胞模型特征频率及振型Fig.1 Characteristic frequencies and mode shapes of spherical and elliptical cell models

2.2 超声场的仿真

仿真模型主要包括压电换能器(非聚焦型，直径为 10 mm，高为 2 mm)、铝壳(厚为 0.5 mm，用作水浴槽)和流体域，如图2所示。压电换能器材料为PZT-5H，流体域为水，相关参数如表2所示。在流体域边界设置完美匹配层(Perfectly Matched Layer,PML)，流体域通过引入PML来截断，PML吸收流体中传播的声波，拉伸类型为有理数。

表2 仿真模型相关材料的参数Table 2 Parameters of materials related to simulation model

图2 仿真模型二维图Fig.2 Two-dimensional diagram of the simulation model

给予换能器上表面 3 Vpp(功率放大器的输出电压峰峰值)激励电压，下表面接地并设为“辊支承”，对模型各结构进行网格划分。通过引言文献[3-11]可知，超声细胞刺激频率都在0.5～2 MHz之间，并结合2.1节仿真结果与商售产品的实际共振频率，本文仿真的换能器频率为0.5 MHz、0.89 MHz和 1.26 MHz，通过计算即可得到辐射的声场分布图，如图3所示，水域场正负声压交替分布，处于换能器中心区域上方的声压最高，随着与换能器的距离增大，声压逐渐降低。

图3 不同频率换能器辐射的声场分布图Fig.3 Distribution nephograms of sound field radiated by transducers of different frequencies

图4显示了在r-z平面上换能器中心轴线r=0处以及径向轴线z=10 mm处的声压分布线图，考虑到不同径向、纵向声场分布趋势较为接近，故以这两处数据作为分析对象。图4(a)显示出距离换能器中心 2～4 mm 范围内时随着距离的增加声压快速降低，由4 mm以后逐渐减小并在零声压场波动变化，对比图4(a)和4(b)可以看出，换能器中心处声压明显高于两边，而且随着径向距离的增加，声压变化较慢，但总体为减小趋势。通过仿真结果可知，细胞刺激时为避免声压过高或过低，横向距离可维持在距离换能器中心4 mm左右范围内，接近换能器的实际尺寸，由于纵向声压幅度变化较慢，纵向距离可根据实验需要选择，本研究选择距离换能器约10 mm的位置。

图4 声场中声压沿中心轴线r=0 mm和沿径向轴线z=10 mm的分布Fig.4 Sound pressure distribution along central axis of r=0 mm and along radial axis of z=10 mm in the sound field

3 超声刺激对鱼卵胚胎细胞的影响

为研究不同超声参数下斑马鱼鱼卵胚胎的生长情况，本文设计了一种超声刺激装置，并通过三因素三水平正交试验 L9(34)进行了实验测试，主要因素包括信号激励电压、刺激时间和超声频率。

3.1 超声细胞刺激系统

超声细胞刺激系统共包括冷却箱、水浴箱控制装置和超声刺激驱动系统三部分，如图5所示。冷却箱主要是通过半导体制冷片进行冷却箱内部循环水的降温。超声刺激驱动系统主要包括信号发生器(北京普源RIGOL DG1012)，ATA-10功率放大器(西安安泰电子科技有限公司，内部包括阻抗匹配器，机箱尺寸为260 mm×160 mm×60 mm)。

图5 超声细胞刺激系统Fig.5 Ultrasonic cell stimulating system

水浴箱控制装置主要包括水浴槽、培养皿、显示单元、三种压电陶瓷超声换能器(非聚焦型，频率分别为0.5 MHz，0.89 MHz和1.26 MHz)、温度控制检测单元、循环水控制单元以及中央控制单元等部分。斑马鱼鱼卵细胞最适生长温度约为28℃，为了得到良好的刺激环境，本装置通过 DS18B20温度传感器实时进行水温检测，温度偏低时通过加热片给予水温补偿，当水温超过28℃时通过循环水控制单元和冷却箱对水浴槽进行降温。超声换能器以阵列形式固定于水浴槽的底部，可以通过控制装置对相应频率的换能器进行选择性激励，因换能器在工作时会引起其正上方水槽底部的水温升高(当水浴箱循环水关闭时，约升温1.0℃)，可能会影响该位置处细胞生长，如图6所示，故通过循环水控制单元驱动水泵均匀水浴槽内的水温，并起到一定的降温作用。由于24孔板处于换能器上方10 mm左右处，经测得该处水温变化不足 0.2℃，故忽略水温对鱼卵的影响。

图6 水槽中初始水温和工作水温的分布图Fig.6 Distribution nephograms of water temperature at beginning and after work in the water tank

超声细胞刺激驱动系统如图5(b)中所示，由信号发生器产生与换能器频率匹配的具有特定激励电压的正弦信号，该信号传输到功率放大器(功率放大器增益×10，输出阻抗为 1 Ω)产生实验所需的超声电功率，并最终驱动换能器产生低强度超声波作用于斑马鱼鱼卵的胚胎细胞。

3.2 斑马鱼养殖系统

将野生型斑马鱼(AB品系)置于 28℃的循环水环境中饲养，光照 14 h/黑暗 10 h交替进行。斑马鱼每天喂食两次鱼食和新鲜孵化的丰年虾。为了收集鱼卵，将成对的(雄性和雌性)斑马鱼放置在产卵盒过夜。将收集到的鱼卵每100个放在一个培养皿中，用10 mL培养液在28°C下培养，直到它们达到实验所需的发育阶段。装有斑马鱼卵的培养皿被保存在一个恒温28°C的培养箱中，其光-暗周期与水生设施相同。每天至少交换一半培养皿的水量。

3.3 正交试验方案

通过预实验及相关文献资料可知，斑马鱼鱼卵正常孵化时间为3天左右。刺激开始前将鱼卵置于培养箱中培养32h左右，每隔一定时间清除死卵(含有白斑)，鱼卵胚胎细胞如图7所示，多为圆球形或椭球形。根据前期预实验，确定影响鱼卵孵化的主要因素与水平，其中刺激时间为10、20、30 min，信号激励电压为3、6、9 Vpp，超声频率为0.5、0.89、1.26 MHz，具体参数如表3所示。

表3 鱼卵孵化正交试验因素水平表Table 3 Orthogonal test factor level table of fish egg hatching

图7 斑马鱼胚胎细胞Fig.7 Zebrafish embryo cells

选取健康的200颗鱼卵，分为10组，每组20颗，一组为对照组，其余九组为正交试验组。将每组鱼卵分别置于相应换能器上方的24孔板的孔内，调整实验参数，进行刺激实验，对照组给予空白超声刺激。将刺激后的鱼卵置于培养箱中培养，并定期统计孵化数目。实验结果的评判指标为鱼卵孵化指数[13]：

其中：IG为孵化指数，tD为观察周期，本实验以对照组开始孵化后 3h为一个周期，tG为一个周期内的孵化个数。孵化指数表示鱼卵的活力指标，指数越大，鱼卵活力越高。

鱼卵化正交试验方案及孵化指数如表4所示。假设因素间无交互影响，为减小系统误差，专门在表4中设置了空列。

表4 鱼卵化正交试验方案及孵化指数Table 4 Orthogonal test plan and hatching index of fish eggs

3.4 正交试验结果分析

对实验结果遵循极差分析法原则，计算各因素列取水平i(i=1, 2, 3)时所得孵化指数的算数平均值ki，以及各列的极差R，结果如表5所示。

根据表4可以看出，除了部分正交组(2组和5组)，其余各组孵化指数均高于对照组，说明适当超声刺激可加快细胞生长。根据表5可知，由于极差RC＞RA＞RB，所以各因素从主到次顺序为：C(超声频率)，A(刺激时间)，B(信号激励电压)，其中空列高于B列，本文推测是由于不同频率换能器在相同激励电压下输出电流有所波动，影响了刺激效果而引 起 的 。 同 时 ， 由 表 4可 知 ，k3A＞k2A＞k1A，k1B＞k3B＞k2B，k3C＞k1C＞k2C，故最优方案为(即超声频率为 1.26 MHz，刺激时间为 30 min，信号激励电压为 3 Vpp)。该方案不在正交试验组内，是通过数据分析得出的，这体现了正交试验的价值与优势。正交组最大孵化指数(4组)为29.7，为此，需要通过进一步实验验证该方案是否为最佳方案。

表5 试验结果分析Table 5 Analysis of test results

3.5 超声刺激参数的优化分析

表6 优化方案组和对照组及最佳正交组的孵化指数对比Table 6 Comparison of hatching index between optimized scheme group, control group and optimal orthogonal group

综上所述，细胞在适当的超声条件刺激下，细胞膜发生共振产生一系列生物效应，其中空化气泡引起声孔效应从而改变细胞膜的通透性，加快细胞内外物质传输和细胞生长，从而促进斑马鱼胚胎细胞的孵化。

4 结 论

本文通过圆球形和椭球形细胞膜固有频率的相关理论研究，分析了超声空化微泡的振动和破裂产生的声孔效应对细胞膜通透性的机理影响，通过仿真得到圆球形和椭球形细胞膜的特征频率，从而确定了实验频率选择范围。根据实验需要自行设计了一种超声刺激装置，该装置可以实现水温的检测控制、水流量调节以及超声换能器频率选择激励等功能，以换能器固定于水浴槽底部的方式取代常用的浸入式，该方式换能器参数设置准确方便，能够实现对所刺激环境的整体控制和调节，能有效减小外界因素的干扰。

使用自制装置对斑马鱼鱼卵进行超声刺激实验，通过正交试验和极差分析法，以孵化指数为指标，得到鱼卵孵化的最优方案是超声频率为1.26 MHz，刺激时间为 30 min，信号激励电压为3 Vpp，相应的孵化指数为 33.82，最佳频率与仿真计算所得的圆球形细胞特征频率(1.244 MHz)基本一致，与椭球形细胞特征频率(1.225 4 MHz)较为接近。由此可见，本文前期的理论推导及仿真计算结果可信，实验结果也表明适当的低强度超声刺激可加快细胞生长，促进鱼卵胚胎的孵化，对于生长周期较长的细胞，可以通过该方式加速其生长或增殖，缩短实验周期，提高实验效率。