肺复康方对肺癌癌因性疲乏裸鼠骨骼肌的影响

许双洁 ，杜肖琳，王云启

（1.湖南中医药大学，长沙 410006；2.湖南省肿瘤医院中医/中西医结合科，长沙 410013）

肺癌作为常见的恶性肿瘤，因其高发病率成为全球的“噩梦”［1］。在我国恶性肿瘤患者中，肺癌更是成为了头号死亡原因［2］。癌因性疲乏（Cancer-related Fatigue，CRF）作为恶性肿瘤中常见的并发症，成为近些年医学研究的热点［3］。董亚娜［4］等的临床研究指出：肺癌中CRF发生率高达76.67%，CRF的发生严重影响了肺癌患者的生存质量。最新的NCCN CRF指南（2018版）定义CRF为：一种与恶性肿瘤或其治疗相关的痛苦的、长时间的、主观的、有关躯体、情感或认知方面的疲乏感，与近期活动量不符，并且影响正常生活［3］。何源源［5］等研究表明：CRF可以导致大鼠血浆中ATP水平降低，骨骼肌分裂增强，融合减弱，丙二醛合成增多和谷胱甘肽合成减少。本课题组对肺复康方的前期研究证明：肺复康方可通过提高IL-6水平、降低IL-1β和TNF-α水平，改善lewis肺癌小鼠炎症因子失调状态，有效缓解疲乏症状［6］。本实验以前期研究为基础，进一步探究肺复康方对肺癌CRF裸鼠骨骼肌的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用动物和细胞株SPF级雄性BALB/c裸鼠25只（4周龄，重量在18～22g之间），购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物质量合格证SCXK（湘）2019-0004。lewis肺癌细胞株（货号ZQ0203），购于中乔新舟厂家。

1.1.2 主要试剂及仪器实验试剂：肺复康方组方：百合 10g、赤芍 15g、丹参 15g、麦冬 10g、桑白皮 15g、瓜壳 10g、黄芩 10g、蚤休 10g、半枝连 15g、臭牡丹 10g、黄芪 20g、白术 10g、陈皮10g、谷麦芽各 10g、炮姜 10g、藿香 10g、神曲 10g。以上中药颗粒剂均购于湖南省肿瘤医院中药房。细胞培养所需试剂：DEME basic（1X）高糖（货号C11995500BT）、胰酶消化液（货号25200056）、青链霉素（货号15140122）以上均购于Gibco公司；胎牛血清（货号04-001-1ACS），购于BI公司；磷酸盐缓冲液（货号；SH3025601），购于hyclone公司。BCA试剂盒（货号HG-WDP0003a），购于HonorGene公司；ATP试剂盒（货号A095-1-1）、GSH试剂盒（A006-2-1）、MDA试剂盒（A003-1-2），以上均购于南京建成生物工程研究所。Drp1抗体（货号ab184247），购于英国abcam公司，Mfn1抗体（货号13798-1-AP）和β-actin抗体（货号66009-1-Ig）购于美国Proteintech公司。

实验仪器：HR1500-IIA2型生物安全柜、DW-86L728型医用超低温保存箱、BCD-269WDGG型冰箱（青岛海尔电器有限公司）；HWS-12型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；CKX41型光学倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；5702R型低速冷冻离心机（EPPendorf公司）；3111型二氧化碳培养箱（Thermo公司）；TS-1型摇床（其林贝尔公司）；DYY-6C型电泳仪、DYCZ-24DN型电泳槽、DYCZ-40D型转膜仪（中国北京六一公司）；GL-88B型旋涡混合器（其林贝尔公司）；JB-13型磁力搅拌器和PHS-3C型精密PH计（中国雷磁公司）；BioPreP-24型生物样品均质仪（中国杭州奥盛公司）；自制小鼠鼠尾悬挂板。

1.2 实验方法及检测指标

1.2.1 Lewis肺癌细胞培养将Lewis肺癌细胞株放入水浴锅复苏，后置于含10%胎牛血清的DEME培养基中，在37℃，5%CO2，相对湿度95%的CO2培养箱中培养。隔天换液，2～3d 传代。

1.2.2 分组25只裸鼠随机分为5组，分别为空白对照组，模型组，剂量组（肺复康方低剂量组、肺复康方中剂量组、肺复康方高剂量组）。同组裸鼠同盒饲养，自由饮食，饲养环境安静。

1.2.3 建立肺癌CRF裸鼠模型将培养好的Lewis肺癌细胞用PBS溶液稀释成1×107/mL细胞浓度，按照每只裸鼠0.2mL的量接种于模型组及剂量组裸鼠右侧腋窝皮下。

1.2.4 疲乏状态判定建模后第3周利用鼠尾悬挂实验明确各组裸鼠疲乏程度，判断癌因性疲乏模型是否成功建立。将裸鼠尾巴末端2cm处固定在木板，使其呈倒挂状态，头部距离地面约15cm，左右两侧用挡板隔离裸鼠视线，裸鼠为克服异常体位而挣扎活动，力量耗竭后静止不动呈失望状态，计算每只裸鼠6min内不动时间，并同时观察其挣扎幅度。

1.2.5 药物干预及疲乏程度监测根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表，将肺复康方中药颗粒剂配制为13g/kg（肺复康方低剂量组）、26g/kg（肺复康方中剂量组）和52g/kg（肺复康方高剂量组）。建模后第4周开始药物干预，剂量组每只裸鼠每天给予0.4mL相应剂量的中药干预，早晚各给药1次，每周间隔给药5天，休息2天，共药物干预3周。模型组和空白对照组给予相同剂量生理盐水干预。药物干预的同时通过鼠尾悬挂实验（2次/周）判断各组裸鼠疲乏程度，动态监测剂量组疲乏缓解情况。

1.2.6 裸鼠处死与取材药物干预3周后，用颈椎脱臼法处死裸鼠，解剖分离出后肢腓肠肌，置于冰块中保鲜备用。实验过程中，模型组以及中、高剂量组均有1～2只不同数量裸鼠死亡，为保证实验科学性和严谨性，现取每组别3只样本量。

1.2.7 裸鼠骨骼肌相关检测WB法检测骨骼肌内Drp1和Mfn1蛋白含量。剪取0.025g组织，预冷PBS洗组织，加入250μL RIPA裂解液研磨，裂解10min，离心，提取蛋白，配制10%分离胶，灌胶，用异丙醇封胶。待凝胶，配制4.8%的浓缩胶，灌胶，取160μL蛋白上清，加入40μL 5×loading buffer混匀，沸水煮5min，速冷备用。上样10μL已变性蛋白，恒定电压75V、时间为130min开始电泳，分别切胶Drp1（83KD），Mfn1（86KD），β-actin（42KD），给予 300 mA 持续电流转膜，Drp1、Mfn1约100min，β-actin 约60min，配制5%脱脂奶粉封闭，一抗、二抗孵育，ECL化学发光液与膜孵育1min显色，暗盒内与X胶片曝光5～20分钟，显影冲洗。

ELISA法检测骨骼肌内ATP、MDA、GSH水平：研磨组织，提取骨骼肌内ATP，根据ATP、MDA和GSH测试盒说明书进行操作，然后根据线粒体蛋白浓度进行换算，得出各组骨骼肌中ATP、 MDA 和 GSH 的浓度。

1.3 统计学分析应用SPSS Statistics 25.0软件包进行统计学分析。计量数据采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD或S-N-K检验，P<0.05 为差异有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 肺复康方对裸鼠行为学的影响建模后第3周对各组裸鼠进行鼠尾悬挂实验，实验数据显示，与对照组裸鼠相比，模型组及剂量组失望时间均延长，差异具有统计学意义（P<0.05），提示癌因性疲乏模型建立成功。见表1。

表1 药物干预前各组裸鼠失望时间表

药物干预时对各组裸鼠进行鼠尾悬挂实验判断其疲乏情况。实验数据显示：各时间点模型组和各剂量组失望时间均长于空白组（P<0.05），药物干预d3-d14各剂量干预组裸鼠失望时间与模型组比较无显著性差异（P>0.05）；药物干预后，高剂量组d10、所有剂量组d17、d21裸鼠失望时间明显短于模型组（P<0.05）。结果见表2。

表2 干预时各组裸鼠失望时间表

2.2 肺复康方对裸鼠骨骼肌内相关蛋白的影响应用蛋白印迹法检测各组裸鼠骨骼肌内蛋白表达情况，电泳图显示：Drp1蛋白表达：空白组<高剂量组<中剂量组<低剂量组<模型组。Mfn1蛋白表达：空白组>高剂量组>中剂量组>低剂量组>模型组（见图1）。

图1 各组骨骼肌蛋白Drp1、Mfn1蛋白印迹

与对照组相比，模型组及剂量组骨骼肌内Drp1数值均升高，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，中、高剂量组骨骼肌内ATP数值均明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组 Drp1数值虽下降，但差异不具有统计学意义，考虑药物剂量过低，药效不明显所致；剂量组组内对比，Drp1含量分别是低剂量组>中剂量组>高剂量组，低剂量组和高剂量组差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组和中剂量组、中剂量组和高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05）。

与对照组相比，模型组及剂量组骨骼肌内Mfn1数值均下降，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，中、高剂量组骨骼肌内Mfn1数值均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组 Drp1数值虽升高，但差异不具有统计学意义，考虑药物剂量过低，药效不明显所致；剂量组组内对比，Mfn1含量分别是低剂量组<中剂量组<高剂量组，低剂量组和高剂量组差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组和中剂量组、中剂量组和高剂量组差异不具有统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 肺复康方对各组裸鼠骨骼肌内蛋白的作用

2.3 肺复康方对裸鼠骨骼肌内ATP、GSH、MDA的影响与对照组相比，模型组及剂量组骨骼肌内ATP数值均下降，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，剂量组骨骼肌内ATP数值均明显升高，差异具有显著统计学意义（P<0.01）；剂量组内对比，ATP含量分别是低剂量组<中剂量组<高剂量组，任意两组之间差异具有显著统计学意义（P<0.01），见表4。

与对照组相比，模型组及剂量组骨骼肌内MDA数值均升高、GSH数值均下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，剂量组骨骼肌内MDA数值均下降，差异具有统计学意义（P<0.05），高、中剂量组骨骼肌内GSH数值均升高，差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组GSH数值虽升高，但差异不具有统计学意义（P>0.05），考虑药物剂量过低，药效不明显所致；剂量组内对比：MDA数值分布为低剂量组>中剂量组>高剂量组，低剂量组与中剂量组差异具有统计学意义（P<0.05），中剂量组与高剂量组差异不具统计学意义（P>0.05），考虑剂量过高，肺复康方药物毒副作用所致。GSH数值分布为低剂量组<中剂量组<高剂量组，低剂量组和高剂量组之间差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组和中剂量组、中剂量组和高剂量组组间差异均不具有统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 肺复康方对各组裸鼠骨骼肌内ATP、GSH、MDA的影响

3 讨论

研究表明，CRF发病率逐年攀升［7］，接受手术、化疗、放疗等相关治疗的恶性肿瘤患者普遍存在疲乏症状，CRF可发生在恶性肿瘤发生发展的任一过程，严重影响了患者的生存质量［8-9］。现代医学对CRF的治疗分为药物干预和非药物干预两部分。药物干预包括精神兴奋剂、促红细胞素（EPO）以及皮质类固醇激素等［10］。非药物干预包括体能锻炼、心理指导、光疗、营养支持等［11-13］。中医药在CRF的治疗方面发挥了重要作用，其方式多样，疗效显著，中药汤剂、针灸、穴位贴敷、中药足浴等方式在临床实践中取得了良好的效果［14-17］。肺复康方是我院名中医王云启主任医师总结的经验方，本课题组通过长期临床观察发现肺复康方能够有效改善肺癌CRF症状。

线粒体是机体进行有氧呼吸、制造能量的细胞器，其主要作用是为细胞的各种生命活动提供能量，保持线粒体融合与分裂的动态平衡是其正常功能的重要前提，这种动态平衡一旦因某些因素被打破，机体会因线粒体功能失常而处于疾病状态［5］。本实验研究得出，与空白对照组相比，剂量组及模型组均出现Mfn1表达减弱、Drp1表达增强，表明CRF裸鼠骨骼肌内线粒体分裂增强，融合减弱，氧化损伤的线粒体数量增多，导致供能减少，呈现疲乏状态。剂量组内Mfn1含量高于模型组，Drp1含量低于模型组，表示肺复康方可上调Mfn1表达，下调Drp1表达，促进线粒体融合，减少其氧化损伤，保证持续为机体供能

线粒体同时也是ATP合成的重要场所，ATP是生物体内最直接的能量来源，当线粒体功能受损，ATP合成障碍，生物体会呈现疲乏状态。MDA是由机体内自由基和某些脂质发生过氧化反应产生，是机体氧化损伤的标志［18］；GSH是机体抗氧化功能的指标，其参加参与了脂质过氧化物的清除［19］。当机体骨骼肌内MDA含量增多，GSH含量下降，则提示骨骼肌处于氧化损伤、供能障碍状态，能量来源不足，机体表现出疲乏无力症状。本实验结果表明，MDA、ATP含量：模型组<剂量组<空白对照组，GSH含量：空白对照组<剂量组<模型组。提示CRF裸鼠体内MDA、ATP含量减少，GSH含量增多，肺复康方能够通过增加MDA、ATP含量，减低GSH含量来缓解CRF症状。

本实验在前期研究的基础上，通过建立肺癌CRF裸鼠模型，肺复康方中药干预，测定裸鼠骨骼肌内Mfn1、Drp1蛋白含量及ATP、MDA、GSH含量，探究肺复康方对肺癌CRF裸鼠骨骼肌的干预机制。综上可得结论：肺复康方能够有效缓解CRF症状，其机制可能与兴奋HPA轴，促进CORT分泌、抑制ACTH合成，促进骨骼肌融合，抑制其分裂，减少其氧化损伤有关。