云南新平蔗区发现甘蔗白条病

王长秘，张荣跃，李婕，王晓燕，单红丽，仓晓燕，黄应昆

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远 661699）

0 引言

甘蔗白条病是由白条黄单胞菌[Xanthomonas albilineans(Ashby)Dowson]引起的一种系统性维管束细菌性病害[1]。X.albilineans属于专性好氧型革兰氏阴性细菌，其菌落具有表面平滑、外形圆整、颜色为浅黄色或蜜黄色、菌液粘稠状的特点[2]。X.albilineans能够在甘蔗茎、叶上定殖，在茎上定殖后茎中下部会长出许多侧芽，茎基部出现分蘖，严重时导致植株枯死等症状[3]；在叶上定殖后病原菌从主茎叶、分蘖叶和侧枝叶木质部侵入并产生大量的黄单胞毒素，阻断叶绿体分化从而影响光合作用，形成与叶片主脉平行的白色条纹[1]，导致甘蔗产量和品质的大幅度下降，造成巨大经济损失[3-4]。白条病具有潜伏期，可持续几个月甚至几年未表现出症状[5]。因此，白条病具有危害性大、潜伏期长的特点。

该病19 世纪20 年代在印度尼西亚爪哇岛、澳大利亚和斐济被首次发现报道，现已广泛发生于美国、古巴、巴西、澳大利亚、法国、印度和巴基斯坦等至少66 个国家[6]。1980 年在我国福建、广东、江西、海南、台湾等蔗区均有报道[7-9]。2017年李文凤等[10]利用分子生物学技术手段首次检测到广西北海、来宾、百色蔗区甘蔗白条病病原。2019 年张荣跃等[2]通过病原菌分离和分子生物学鉴定在云南保山、孟定和金平蔗区的甘蔗上也发现了白条病。2019 年在云南新平蔗区发现了疑似白条病的病害，为明确该病害的致病病原，本文采用田间诊断和分子生物学技术相结合方法，开展病原鉴定，为今后白条病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采自云南新平甘蔗‘新台糖1 号’的8份疑似甘蔗白条病样品信息：XP1S（登录号MT625864）、XP2S（登录号MT625865）、XP3S（登录号MT625866）、XP4S（登录号MT625867）、XP5S（登录号MT625868）、XP6S（登录号MT625869）、XP7S（登录号MT625870）、XP8S（登录号MT625871）。

1.2 蔗汁总DNA提取

将蔗茎表面用自来水清洗3 次去除表面污物，75%的酒精消毒20 s 后，用火将表面酒精烧尽，重复2 次进行表面消毒。把蔗茎切成长为5～8 cm 的块茎，通过挤压方法收集蔗汁。吸取2 mL 蔗汁于离心管中，12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，沉淀使用植物基因组DNA 提取试剂盒提取DNA[天根生化科技（北京）有限公司，中国]，具体步骤参照说明书进行操作。

1.3 PCR检测

以蔗汁总DNA 为模板，使用X.albilineans检测特异性引物（XAF1：5’-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3’，XAR15’-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3’）[11]进行PCR 检测。该引物靶标X.albilineans基因组上的三磷酸腺苷结合盒（adenosine triphosphate-biding cassette，ABC）转运蛋白基因（abc），基因号为XALc_1791[12]。25µL 扩增反应体系为dd H2O 10.5µL、2×EasyTaq SuperMix 12.5µL、上游引物0.5µL（20µg/µL）、下游引物0.5µL（20µg/µL）、DNA 模板1µL。PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，65℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10个循环；94 ℃变性45 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，10 个循环；94 ℃变性45 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，10个循环；12 ℃保存。取10µL用1.5%琼脂糖凝胶进行扩增产物电泳检测。

1.4 PCR产物克隆及测序分析

利用胶回收试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，中国）进行PCR产物回收，产物使用pEASY-T5克隆载体（北京全式金生物技术有限公司，中国）进行克隆。挑选5 个阳性克隆送华大基因测序。将测序所得序列在NCBI 官网上BLAST 检索，使用DNAMAN V 8.0 进行序列一致性分析。运用MEGA 6.0 软件结合表1中菌株的核酸序列采用邻接法（Neighbor-joining）建树，模式选Kimura2-parameter，自举检测（Bootstrap）重复1 000次，构建系统进化树（表1）。

表1 构建系统进化树菌株相关信息Table 1 Information of strains for constructing phylogenetic tree

2 结果与分析

2.1 PCR检测

PCR 分子检测结果表明，8 份疑似甘蔗白条病样品XP1S～XP8S 检测到目的条带，大小约为600 bp，与阳性对照条带一致。阴性对照和无菌水对照均没有扩增出目的条带（图1）。

图1 8份疑似甘蔗白条病样品的PCR检测结果Fig. 1 PCR detection of 8 suspected sugarcane leaf scald samples

2.2 序列分析

测序结果表明8个白条黄单胞菌菌株PCR扩增产物核苷酸序列均为608 bp，一致性为100%。将这8条白条黄单胞菌abc基因序列上传NCBI 数据库，GenBank 登录号为MT625864～MT625871。BLAST 结果表明，这些核苷酸序列与来自法国白条黄单胞菌GPE PC73 菌株（GenBank 登录号：FP565176）对应的基因序列完全一致。将本文获得8 条序列结合不同黄单胞菌属的abc基因构建系统发育树（图2）。结果表明，本研究得到的序列与X.albilineans菌株处于同一进化分支，但与同属不同种病菌有明显区分。初步推断这8 份样品感染了X.albilineans。

图2 基于甘蔗白条病菌abc基因核苷酸序列系统进化树Fig. 2 Phylogenetic analysis based on abc genes of X.albilineans strains obtained in this study and other Xanthomonas strains

3 讨论与结论

通过田间症状诊断和PCR 分子鉴定技术，确认云南省新平蔗区发现了由X.albilineans引起的甘蔗白条病。白条病是一种可以从维管束、木质部、韧皮部、薄壁细胞侵染甘蔗的细菌性病害，遇到合适的甘蔗品种和环境条件白条病就可能大面积发生[13-14]。X.albilineans通过砍收过程中的农事操作进行短距离传播，以带病种茎进行长距离传播，其中种茎是最主要的传播方式[15-17]，于是在我国2007 年将致病性白条黄单胞菌X.albilineans列入进境植物检疫名录[18]。通过野生种质资源的挖掘和抗病材料的运用，筛选抗病健康种苗是甘蔗白条病防治的最好方法[19-20]。

19世纪80年代，甘蔗白条病仅在我国台湾、福建、广东蔗区有发生，现在在广西、海南、浙江、云南也有报道[2,10,21-22]。白条病具有危害性大，潜伏期长的特点。因此，必须加强引种检疫和补齐引种检疫的短板，从源头上阻断病害的传播和蔓延。同时应加强该病害的发生情况调查，及时掌握各蔗区白条病发病情况和流行规律，及早做好预防工作，将白条病的发生和危害控制在阈值之下。甘蔗白条病的检测、监测、预警及检疫工作具有重要的意义。本研究是云南新平蔗区白条病发生的首次报道，将为今后白条病的监测、预警、防控研究奠定基础。

Occurrence of Sugarcane Leaf Scald in Sugarcane Planting Area of Xinping,Yunnan Province,China