阿米卡星生产过程中杂质E形成条件探讨及杂质控制策略

舒靖能，廖玉华，盛卫星(浙江金华康恩贝生物制药有限公司 ，浙江 金华 321016)

0 引言

阿米卡星，化学名称为O-3-氨基-3-脱氧-a-D-葡吡喃糖基-(1→6)-O-[6-氨基-6-脱氧-a-D-葡吡喃糖基-(1→4)]-N-(4-氨基-2-羟基-1-氧丁基)-2-脱氧-D-链霉胺，为半合成氨基糖甙类抗生素，以卡那霉素为起始物料合成而来。其作用机制是作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成，并破坏细菌细胞壁的完整性，致使细菌细胞膜破坏，细胞死亡，主要依靠于细菌30S亚基结合，阻断细菌蛋白质合成而起到抗菌作用，适用于革兰阴性杆菌和对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌引起的感染。目前临床上应用比较广泛，有着很好的市场前景。随着一致性评价持续进行，客户的需求不断提升，而且中国药典及各国药典的升版，对阿米卡星的质量要求越来越高。在2020年版《中国药典》中阿米卡星的杂质包含：杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I等，杂质种类繁多，对杂质控制要求较高。阿米卡星作为本公司的拳头产品，在国内外市场均有销售，产量大、效益好，占有较大的市场份额，对于杂质的研究就非常有必要。通过杂质研究能够对产品带来较大的帮助，一方面可以减少杂质产生，提升质量，另一方面，反应过程杂质合成减少以后又能增加收率，降低生产成本。本次我们着重对杂质E进行研究，试图找到杂质E的形成条件并进行杂质控制。

1 检测方法的建立

1.1 衍生化后的HPLC法

衍生化处理过程中使用到的衍生剂2,4,6-三硝基苯磺酸的实验操作安全性影响较大；衍生化法干扰因素多，如不同厂家的试剂有明显差异，致使部分杂质的结果重现性差，不利于产品质量的全面控制，且衍生需要的时间较长。

1.2 薄层层析(TCL)方法

工艺中控方法采用TCL进行监控，杂质的分离度不够，所监控的杂质有限，不能监控工艺中所涉及的大量杂质，中间生产过程不能有效的进行监控。为了改变目前中控手段的短板，拟对药典方法进行借鉴，建立中控检测方法。目前在使用的阿米卡星药典方法有欧洲药典电化学方法和中国药典末端吸收方法。但由于欧洲药典的有关物质检测方法采用电化学检测器，该检测器使用金电极，金电极比较脆弱，一般适合于纯度较高的成品检测，不适合对产品的中间控制。故最终采用中国药典的末端吸收方法来进行检测与有关物质的控制，该法具有检测样品处理简单、检测时间短、专属性强、灵敏度高、重复性好的优点。

分析方法的建立：

供试品溶液：取本品适量，加流动相A溶解并稀释制成每1 mL中约含5 000 u单位的溶液，作为供试品溶液；

对照溶液：精密量取适量，用流动相A稀释制成每1 mL中约含0.05 mg的溶液，作为对照溶液；

色谱条件：按照本公司高效液相色谱法标准操作规程试验，引用2020年版中国药典二部的规定[1]。

按下式进行计算：

式中：Ru为供试品峰面积；Rs为对照品峰面积。

并对专属性、精密度、定量限、检测限等方面进行了确认。

在完成过程检测方法优化后，着重对阿米卡星杂质E进行了研究。

2 阿米卡星杂质E形成条件探讨及合成条件控制

2.1 阿米卡星杂质E形成条件

目前阿米卡星生产工艺常采用卡那霉素经过硅烷化保护氨基后与PHBA活性酯酰化来制备，再经过水解、肼解、过柱、结晶得到。其中硅烷化的合成路线如图2所示下[2]。

图2 硅烷化的合成路线

杂质E为阿米卡星的杂质之一，根据药典杂质结构分析为卡那霉素的6′位的氨基加上了AHBA侧链。而卡那霉素分子中有4个氨基分别为1，3，6′，3″四个位置的氨基，每个氨基都可参与反应，这些氨基未进行保护而直接与活性酯反应时，6′位的氨基反应活性最大，但这不是需要的产物。因此需要改变氨基的活性，让1位的活性最大，最大量的生成阿米卡星。因此通过硅烷化保护反应后，1位上的氨基活性最强，6′位变成最弱，合成产物以阿米卡星为主。对生产过程中的肼解后滤液进行了检测，发现杂质E含量平均达到了3.5%，杂质水平偏高，通过前述合成路线分析认为硅烷化保护程度影响杂质水平。为此，我们将通过开展一系列的实验进行摸索确认影响杂质E的合成条件，并找到最佳反应条件进行杂质控制。

2.2 杂质合成条件控制

合成路线：将一定量的卡那霉素投入无水乙腈中，加入六甲基二硅烷胺，再加入三甲基后升温，到达回流温度，回流一定的时间后结束降温，再经过酰化、水解、肼解。从合成路线中我们分析得到两个主要影响因素，六甲基二硅烷胺的量及回流反应时间，这两个因素影响着硅烷化对氨基的保护程度，下面就这两个因素开展以下实验：

2.2.1 实验部分

(1)六甲基二硅烷胺的使用量

在四口烧瓶加入300 mL无水乙腈，投入46.0 g卡那霉素(分子量为484.5，94.94 mmol)，加入六甲基二硅烷胺(分子量为161.39)，再加入10 g三甲基氯硅烷后升温，到达回流温度后回流1.5 h。针对六甲基的使用量，设置了摩尔比1∶0、1∶2、1∶5.5、1∶6.5、1∶7.5等5种情况，做到肼解后滤液(上柱分离前中间体)结果如表1所示。

表1 六甲基二硅烷胺量的影响

从表中可以看出卡那霉素与六甲基二硅烷胺摩尔比1∶6.5时，杂质E的含量已经最低，是最佳条件之一。把这个因素固定后，又对回流反应时间开展实验。

(2)硅烷化回流反应时间

设置了回流时间2、4、6、8 h四种情况，做到肼解后滤液(上柱分离前中间体)，结果如表2所示。

表2 硅烷化回流反应时间的影响

从表2可以看出回流时间为4.5 h时，杂质E的含量最低，是最佳条件之一。

2.2.2 合成控制小结

通过六甲基二硅烷胺的使用量量及硅烷化反应时间两个条件的探索，发现卡那霉素与六甲基摩尔比在1∶6.5，反应时间在4.5 h为最佳，杂质E的含量最低在1%左右，而我们的收率也最高，达到了61.5%，收率提升了2.5%左右。

2.3 杂质E的柱层析控制

通过柱层析分离对合成料液进行分离，达到纯化的目的。柱层析是一个杂质分离过程，主要是通过树脂上柱吸附和解析剂洗脱达到分离的效果来去除料液中的未反应的卡那霉素及其他杂质如杂质E。由于柱层析的周期长，对过程的控制尤为重要。建立前述的中控检测方法以后，对杂质E的解析过程进行了有效监控，杂质E得到有效控制。通过这样的控制杂质E控制在0.1%以内，达到了较好的分离效果。

3 结语

本次研究首先建立了阿米卡星中间体的中控方法，该方法具有样品处理简单、检测时间短、专属性强、灵敏度高、重复性好的优点。其次对杂质E形成条件进行探讨，并利用中控方法，对合成条件进行研究，确立了最佳的合成条件。再次对柱层析过程加强控制，控制杂质E在0.1%以内。通过本次研究，一方面提升了合成步骤的收率，提升2.5%，另一方面有效降低了杂质E的含量，为柱层析减轻压力，保证了产品质量，取得了比较理想的成果。