地稔总多酚的含量测定方法的研究*

钱 松，麻秀萍，杨秋丽，刘 静，刘林莉

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

地稔为野牡丹科植物地稔MelastomadodecandrumLour.的新鲜或干燥全草，别名土茄子、山辣茄、铺地锦、嘎狗噜、地枇杷等，收载于2003版《贵州省中药材﹑民族药材质量标准》中，主要分布在广东、贵州、浙江、福建等地区。地稔归心、肝、脾、肺经，性凉，味甘、涩，主要功效为活血止血、清热解毒，民间常用于治痛经、产后腹痛、子宫出血、崩漏、痈肿、痔疮、盆腔炎、肝炎等病症[1]。而现代药理研究表明地稔止血与抗炎功效显著，并有抗衰老、降血糖、降血脂、抗肿瘤等作用[2-4]。地稔的药材资源丰富，使用范围广泛，临床疗效显著，具有广阔的开发利用前景。

地稔所含化学成分多样，其主要成分有黄酮类、多糖类、内酯类、有机酸等成分[5-9]。而目前在地稔质量控制等方面，多以没食子酸、槲皮素等成分为主，鲜见地稔中多酚含量的报道[10]。因此，对民族药地稔总多酚含量的测定方法的研究，为其质量控制和深入开发研究提供理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-5900型紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；FA2204N型分析天平(上海菁海仪器有限公司)；JP-150A型高速多功能粉碎机(永原市久品工贸有限公司)；水浴锅(上海浦东物理光学仪器厂)；AG285型电子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 试药

没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110831-201605，含量为90.8%)：福林酚试剂(上海蓝季生物，批号160825)；无水碳酸钠(西陇科学股份有限公司，批号171016)；蒸馏水。

1.3 样品

12批次地稔药材分别购自贵州、福建、广东等地，经贵州中医药大学生药教研室孙庆文教授鉴定为野牡丹科植物地稔MelastomadodecandrumLour.的全草。12个批次地稔药材产地来源见表1。

表1 样品编号Tab.1 Numbers of the samples

2 方法及结果

2.1 供试品溶液的制备

精密称定地稔药材粉末(过2号筛)0.1 g，置于50 mL圆底烧瓶中，精密加入25 mL水，称定重量，70 ℃水浴回流1 h，冷至室温，再称定重量，用水补重，过滤，取续滤液，即得，备用。

2.2 对照品溶液制备

精密称取没食子酸对照品1.3 mg，置于25 mL棕色容量瓶内，加水溶解，并定容至刻度线，摇匀，即得。

2.3 Folin-Ciocalteu法[11]

2.3.1 检测波长选择

① 待测样品溶液光谱扫描

精密量取上述地稔供试品液1 mL，于25 mL容量瓶中，加10 mL水稀释，摇匀，加入1.5 mL福林酚(FC)试剂，摇匀，在8 min内加入10%的Na2CO3溶液6 mL，摇匀，用水稀释至刻度，摇匀，避光1 h，在200～800 nm波长范围内进行光谱扫描，结果如图1。

图1 待测样品溶液光谱扫描图Fig.1 Spectral scan of the solution of the sample to be tested

② 对照品溶液光谱扫描

精密量取没食子酸对照品溶液0.2 mL，按2.3.1项下①方法进行光谱扫描，结果如图2。

图2 对照品溶液光谱扫描图Fig.2 Spectral scan of the reference solution

③试剂空白溶液光谱扫描

精密量取地稔供试品液1 mL，于25 mL容量瓶，加水至刻度，摇匀，避光1 h，在200～800 nm波长范围内进行光谱扫描，即得。结果如图3。

图3 试剂空白溶液光谱扫描图Fig.3 Spectral scan of the solution of the samplewithout the reagents

④试样空白溶液光谱扫描

精密量取1 mL水，按2.3.1项下①方法进行光谱扫描，结果如图4。

图4 试样空白溶液光谱扫描图Fig.4 Spectral scan of water

⑤ 待测样品和待测标准品扣除溶剂空白的600～800 nm波长扫描，结果如图5。

1-地稔药材供试品；2-地稔浸膏供试品；3-没食子酸标准品。图5 待测样品和标准品波长扫描图Fig.5 Spectral scan of the sample to be tested andthe standard substance

由图1至图5，可得出在200～400 nm波长范围空白溶剂吸收强，且吸收峰比较多，由此可知溶剂干扰影响较强，且在此范围出现急尖的峰，造成误差大，违反波长选取干扰最小原则，则不考虑200～400 nm为检测波长；显色剂空白在400～800 nm有吸收峰，试样空白在400～600 nm只有一个吸收峰，在600～800 nm吸收峰相对较少，样品溶液和标准品溶液在600～800 nm吸收增强，根据吸收最大原则，可将检测波长范围定在600～800 nm，如图5，由扣除试样空白表格和扣除显色剂空白表格数据比较分析得到检测波长为751 nm较适宜。故选择751 nm波长为检测波长。

2.3.2 福林酚(FC)试剂用量考察

精密量取6份地稔供试液1 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加入10 mL水稀释摇匀，再分别加入1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL的FC试剂，摇匀，在8 min内各加入10%Na2CO3溶液6 mL，摇匀，用水定容至刻度，30 ℃避光反应1.0 h，以试剂空白作参比，在751 nm波长下测吸光值，结果如表2。

表2 福林酚(FC)试剂考察结果Tab.2 Results of tests on Folin phenol reagent

2.3.3 10%Na2CO3用量考察

精密量取6份供试品液1 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加入10 mL水稀释摇匀，各加入福林酚(FC)试剂3 mL，摇匀，在8 min内分别加入10%Na2CO3溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，摇匀，加水定容，30 ℃下避光1.0 h。再取1 mL地稔供试品液，相同操作方法，作为空白对照，在751 nm波长下测吸光值，结果如表3。

表3 10%碳酸钠考察结果Tab.3 Results of tests on 10%Na2CO3

2.3.4 显色时间考察

精密量取1 mL地稔样品液，于25 mL容量瓶中，各加入10 mL水稀释摇匀，加入3 mL福林酚，在8 min内分别加入6 mL10% Na2CO3溶液摇匀，加水定容至刻度线，30 ℃下避光分别反应0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，结果如表4。

表4 显色时间考察结果Tab.4 Results of tests on color development time

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

精密吸取没食子酸对照品溶液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL分别置于25 mL容量瓶中，加入10 mL水摇匀，加福林酚(FC)试剂3 mL，摇匀，在8 min内分别加入10% Na2CO3溶液6 mL，摇匀，加水定容至刻度线，30 ℃下避光显色2.0 h，751 nm波长下测吸光度，以没食子酸浓度(c)为横坐标、吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程Y=0.1404X+0.0089，r=0.9999。在1.0409～6.2456 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度考察

精密量取没食子酸对照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“2.4.1”中条件重复测定5次。结果没食子酸对照品吸光度相对标准偏差RSD为0.15%，表明仪器精密度良好，如表5。

表5 显色时间考察结果Tab.5 Results of tests on color development time

2.4.3 重复性考察

取地稔药材粉末(贵州省罗甸县边阳镇)6份，精密称取，按2.1项操作，得各样品供试液。精密量取0.5 mL供试液，按“2.4.1”中条件方法进行检测，计算多酚类含量，结果如表6。

表6 重复性考察结果Tab.6 Repeatability test results

2.4.4 稳定性考察

地稔供试液显色反应完全(2.0 h)后测在0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min时的吸光度，由吸光度的变化和RSD值来评价该比色法的稳定性，结果如表7。

表7 稳定性考察结果Tab.7 Stability test results

2.4.5 加样回收率考察

取地稔药材粉末(贵州省罗甸县边阳镇)6份，精密称定，按样品含量-对照品(1∶1)的比例加入对照品溶液(没食子酸)，按2.1项操作，得各样品供试液。精密量取0.5 mL供试液，按“2.4.1”中条件方法进行检测，计算加样回收率及RSD值，结果该方法准确性良好，如表8。

表8 加样回收率实验结果Tab.8 Results of spiked recovery tests

2.5 不同产地样品测定

按“2.1”项下方法制备各批次地稔药材的供试液，平行两次。按“2.4.1”中条件方法进行检测，计算各批次多酚类含量，结果如表9。

表9 不同产地地稔总多酚含量的测定结果Tab.9 Determination results of total polyphenols inMelastoma dodecandrum from different producing areas

3 讨论

通过Folin-Ciocalteu比色法对样品溶液光谱扫描，得到其在波长751 nm处的吸收最大，干扰最小。并对FC试剂和10%Na2CO3用量体积和反应时间等因素进行考察，优选出地稔总多酚的最佳测定条件为FC试剂为3 mL，10%Na2CO3为6 mL，30 ℃下避光反应2.0 h；没食子酸含量在1.0409～6.2456 μg/mL范围内与吸光度线性关系良好，相关系数r=0.9999；RSD均小于3.0%；所建立的福林酚比色法准确度高，精密度好，重现性好。用该方法对12批不同产地地稔总多酚含量进行测定，其含量范围在1.97%～6.17%，其中以贵州榕江县栽麻乡含量最高。

现代药理研究表明多酚具有抗衰老、抗氧化、保护心脑血管、抗炎、抗肿瘤等作用，而从地稔药材总多酚含量的测定可得其含量较高，研究者可深入研究地稔总多酚在这些方面的药理作用，建立谱效关系并探明作用机制与物质基础，加以开发利用。而目前在地稔已有文献方面，鲜见地稔总多酚含量的报道。因此本实验建立的地稔药材中总多酚含量的测定方法，可为评价和控制民族药地稔的质量提供参考，也为其深入开发研究奠定了基础。